【摘 要】
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羊痘病毒属于痘病毒科,包括山羊痘病毒、绵羊痘病毒和疙瘩皮肤病病毒,分别引起山羊、绵羊和牛的严重疾病,典型的临床特征为发热和皮肤表面丘疹、水疱、脓疱、结节和结痂,发病率高,对幼畜致死率较高。羊痘病毒分离株通过鸡胚连续传代使其毒力减弱,生产的弱毒疫苗免疫效果很好。由于羊痘病毒基因组较大,可以容纳较大量的外源基因而不影响其自身正常复制,因此可以以羊痘病毒疫苗株为载体,插入其他病原的保护性基因,构建二价或
【基金项目】
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兵团区域创新引导计划项目“狂犬病毒G蛋白—羊痘病毒重组疫苗的优化及推广应用”的部分研究成果（项目编号:2021BB014）,课题主持人:李有文 教授（塔里木大学）；
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羊痘病毒属于痘病毒科,包括山羊痘病毒、绵羊痘病毒和疙瘩皮肤病病毒,分别引起山羊、绵羊和牛的严重疾病,典型的临床特征为发热和皮肤表面丘疹、水疱、脓疱、结节和结痂,发病率高,对幼畜致死率较高。羊痘病毒分离株通过鸡胚连续传代使其毒力减弱,生产的弱毒疫苗免疫效果很好。由于羊痘病毒基因组较大,可以容纳较大量的外源基因而不影响其自身正常复制,因此可以以羊痘病毒疫苗株为载体,插入其他病原的保护性基因,构建二价或多价的重组疫苗,实现打一针防多病的的目的。但构建过程较为复杂,为了更好的利用羊痘病毒疫苗株构建多价疫苗,本研究构建了用于表达外源基因的羊痘病毒表达系统。本研究分别以pG-klp2-VV7.5-GFP、pUC18-p11-gpt-VV7.5质粒、p UC18-I1L-LaczVV7.5质粒为模板,用PCR的方法扩增出VV7.5-GFP-loxp（重组酶）、p11-MCS（多克隆位点）-loxp-gpt-VV7.5和I1L-MCS-loxp-Lacz-VV7.5三个联合基因片段,分别将p11-MCS-loxp-gpt-VV7.5和I1L-MCS-loxp-Lacz-VV7.5两个基因片段通过Bsi WI酶切后连接至p GEM-TK13载体的Acc65Ⅰ位点,构建两个质粒,然后将VV7.5-GFP-loxp基因片段连接至构建好的载体中的新片段3′端的Bsu36I位点内,鉴定构建成功后,提取质粒,用Lipofectamine 2000转染已经感染山羊痘病毒弱毒疫苗株GTPV AV41的羔羊睾丸细胞,每12 h在荧光显微镜下观察,36～48 h后用低熔点琼脂糖固定,挑取荧光斑点于D MED中,于-20℃～37℃反复冻融3次,10倍比稀释后再接种羔羊睾丸细胞,再镜下观察、挑荧光斑点、稀释、接种,如此反复4～6轮,直到所有细胞全发出荧光,提取其基因组做PCR鉴定。结果将VV7.5-GFP-loxp分别与p11-MCS-loxp-gpt-VV7.5、I1L-MCS-loxp-Lacz-VV7.5两个基因片段构建至载体得到重组转移质粒p GM-TK13-p11-MCS-loxp-gpt-VV7.5、pG M-TK13-I1L-MCS-loxp-Lacz-VV7.5,两个转移载体分别转染接种过山羊痘病毒GTPV AV41疫苗株的羔羊睾丸细胞后,产生绿色荧光的细胞,挑取荧光并将子代病毒悬液传代5次后,通过PCR鉴定得到纯化的重组病毒pGM-TK13-p11-MCS-loxp-gpt-VV7.5。
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