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日本囊对虾是我国对虾养殖的重要品种,由于其相对较耐低温,而且抗病害能力较强,近年其养殖面积和规模迅速增加,尤其是在北方。随着养殖规模的扩大,日本囊对虾健康养殖的环境也越来越严峻,病害爆发越来越频繁。金属硫蛋白(Metallothionein,简称:MT)是一类广泛存在于生物体中的低分子量金属结合蛋白,具有解毒重金属、清除体内自由基、参与免疫调节等生物学功能。MT的重金属解毒功能能够减少重金属类杀菌杀虫药物和环境污染重金属对对虾的毒性。众多学者认为MT具有作为环境重金属污染监测生物指标的潜质。MT的以上功能使其在对虾健康养殖中具有很大的潜在应用前景。 本文以日本囊对虾为研究对象,采用常规PCR、RACE等方法,首次获得了日本囊对虾MT cNDA基因,采用生物信息学的方法对其cDNA及基因序列、所编码蛋白的理化性质、系统进化关系等进行了预测和分析。研究了重金属Cd2+对日本囊对虾幼虾的毒性,通过Real-Time PCR探索了MT在日本囊对虾各组织中的表达水平,以及在重金属Cd2+污染处理时,肝胰腺中MTmRNA的表达量变化。获得了以下主要结果: 1.日本囊对虾MT cDNA(GeneBank登录号:KP226136)序列全长549bp,包含177bp的开放阅读框(ORF),68bp的5非编码区(UTR)及304bp3非编码区(UTR),编码58个氨基酸。序列对比结果显示,日本囊对虾MTcDNA序列与斑节对虾的金属硫蛋白cDNA序列相似度最高,为76%。通过软件分析得出日本囊对虾MT的理论分子质量为6180.3Da,等电点8.28,不稳定指数(Ⅱ)为51.66,脂肪族指数为3.45,不含信号肽。亲水性总平均值(GRAVY)值为-0.719,是亲水性蛋白。 2.采用Real-Time PCR技术分析了MT在日本囊对虾各组织中的表达,结果显示MT基因在不同组织中广泛表达,在日本囊对虾的肝胰腺、鳃、胃、肠、肌肉、心脏、眼柄中均有检测到表达,但表达量存在差异。表达量最高的组织是鳃,其次是胃和肝胰腺。其他组织如肌肉、心脏、眼柄、肠的表达量都非常低。 3.日本囊对虾重金属Cd2+的96h毒理实验表明,Cd2+对日本囊对虾幼虾(平均体重为3.43g)的安全浓度为7.76μmol/L(0.88ppm)。在Cd2+的96h污染实验条件下,随着环境重金属Cd2+浓度的升高,MT的表达量也随之升高。日本囊对虾重金属Cd2+的30d污染实验表明,日本囊对虾肝胰腺MT的表达量存在上限,当实验虾表达的MT不足以解除Cd2+毒性时,产生Cd2+中毒。在Cd2+安全浓度以内,实验虾能够存活并生长,但生长速度受到一定抑制;超过了安全浓度,实验虾表现出病变并出现死亡。96h短期污染实验和30d长期污染实验结果结合表明,MT作为环境重金属污染监测的生物指标不受时间影响。 本文的研究结果将有助于更深入探讨日本囊对虾MT的生物学功能及应用,为日本囊对虾健康养殖提供了重要的基础资料。