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生物体内蛋白质之间的相互作用在生命过程中起着至关重要的作用。据此设计和制备抑制剂的策略,目前已在多种疾病的干预性治疗中得到验证。抑瘤蛋白p53及其负性调节蛋白MDM2之间的相互作用与众多肿瘤发生、发展密切相关。通过抑制p53与MDM2的结合,可恢复p53抑瘤活性而达到抗肿瘤效果。据保守估计,至少25%的肿瘤患者有望经此类策略治疗而受益,因此p53-MDM2抑制剂具有成为今后主要抗肿瘤药物的潜力。p53-MDM2抑制剂主要分为小分子化合物和多肽两大类,其中多肽与小分子化合物相比,具有高亲合力和高选择性。但目前针对p53-MDM2的多肽抑制剂研究仅停留在分子水平,主要原因在于：1)生理环境下多肽稳定性差,易被酶降解而丧失活性；2)靶点位于细胞内,一般多肽不具备入胞能力,无法实现其药效。为此,我们以此作为切入点,设计和制备稳定性好、对p53-MDM2抑制能力强的多肽,并采用主动靶向递药策略,实现肿瘤细胞内的多肽递送,发挥其抗肿瘤作用。本论文分为两大部分介绍。第一部分主要开展了抑制p53与MDM2结合的多肽设计、制备和表征。采用蛋白“嫁接”策略,以能够与MDM2蛋白特异性结合的序列为模拟对象,选用具有三维结构的微型蛋白毒素为模板,通过关键位点的“嫁接”,以期得到稳定性好、对p53-MDM2抑制能力强的多肽。首先,以天然p53序列为模拟对象,以蝎毒毒素BmBKTx1为模板,将p53上结合MDM2的关键位点“嫁接”到蝎毒微型蛋白上,经分子水平表征,设计产物stoppin-1能特异性结合MDM2,具有抑制p53与MDM2结合的能力；借鉴阳离子穿膜肽入胞原理,设计具有穿膜能力的微型蛋白stoppin-2,经细胞水平表征,stoppin-2可通过抑制p53与MDM2结合而选择性杀伤肿瘤细胞；稳定性实验显示,与直链短肽(17-28)p53相比,stoppin-2在近似生理环境下的稳定性大大增强。结果提示,以微型蛋白毒素为模板设计p53-MDM2多肽抑制剂的策略是可行的。其次,开展了p53-MDM2多肽抑制剂的优化设计,选用具有更强MDM2结合能力的PMI序列为模拟对象,以结构更简洁、制备更容易的蜂毒明肽apamin为模板,通过丙氨酸扫描和端基截取技术获取PMI的关键位点和区域信息,进行蛋白“嫁接”优化,获得抑制p53与MDM2结合的微型蛋白stingin。表征结果表明,stingin结合MDM2能力强(Kd=17nM),具有制备容易、产率高、应用前景好的特点。最后,根据镜像噬菌体展示技术筛选结果,制得了全D型的p53-MDM2多肽抑制剂D-PMIα并进行了表征。D-PMIα结合MDM2的能力(Kd=200nM)尽管低于stingin,但因其分子全部由D型氨基酸构成,其稳定性大幅提高,具有深入研究价值。第二部分主要开展了p53-MDM2多肽抑制剂的肿瘤细胞靶向递送和抗肿瘤药效研究。选用能与肿瘤细胞表面整合素ανβ3特异性结合的RGD序列多肽,并修饰于脂质体给药系统表面,将p53-MDM2多肽抑制剂递送至体内外肿瘤细胞内,以期发挥其抗肿瘤效果,提升多肽的应用价值。首先,制备了功能性脂质膜材料c(RGDDYK)-PEG3400-DSPE,采用逆向蒸发法构建了包载stingin-5(L型多肽)和D-PMIα(D型多肽)的c(RGDDYK)-脂质体给药系统。结果表明,c(RGDDYK)-脂质体能有效包载多肽,该脂质体给药系统平均粒径为70-90nm,包封率约30%,可用于后续药物递送研究。其次,以人脑胶质瘤U87为模型,对多肽经递送入胞后的体内外抗肿瘤活性进行评价。细胞水平试验结果表明,stingin-5抑制肿瘤细胞生长活性(IC50≈4.5μM)与阳性对照Nutlin-3 (IC50≈4.0μM)相当,D-PMIα(IC50≈1.9μM)明显强于Nutlin-3,提示c(RGDDYK)-脂质体能有效递送多肽入胞并发挥其抗肿瘤活性,D型多肽D-PMIα综合抑制肿瘤生长效果好于L型。以U87皮下移植瘤和脑部原位肿瘤为模型,选用D型多肽D-PMIα进行体内靶向递送药效评价。结果表明,c(RGDDYK)-脂质体-D-PMIα能显著抑制皮下移植瘤生长、延长脑部原位肿瘤裸小鼠的生存时间。细胞和体内水平均验证了多肽通过抑制p53与MDM2结合、释放p53蛋白而发挥抗肿瘤作用。结果提示,通过主动靶向给药策略,可解决p53-MDM2多肽抑制剂在体内发挥抗肿瘤药效问题。最后,在上述研究工作基础上,以D-PMIα经优化得到的的D-PMIβ为研究对象,在多肽N端修饰脂肪酸以提高其脂溶性,采用薄膜水化法构建了包载该多肽的c(RGDDYK)-脂质体,并进行了体内外药效评价和作用机制探讨。结果表明,多肽脂肪酸化后有利于脂质体包载,且载药量高、稳定性好、制备工艺简单,体内外抗肿瘤药效良好,具有较好的应用前景。综上所述,本文通过多学科的研究手段,设计和制备了抗肿瘤多肽,尤其是D型多肽,解决了多肽药物稳定性问题、提高了其抑制p53与MDM2结合的活性；借助主动靶向递送策略,解决了该类多肽进入细胞的问题,使其在体内外表现出良好的抗肿瘤药效和较理想的治疗指数。高效低毒是抗肿瘤药物研究的长远目标,本研究工作可能为抗肿瘤药物研发带来有益的启示。