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阿尔茨海默病(Alzheimer’s disease,AD)隐匿起病,引起中枢神经系统内多个重要区域呈逐渐进展的退行性改变,是痴呆的主要病因。以β-淀粉样蛋白(amyloid-beta,Aβ)为靶点的免疫治疗临床试验近期宣告失败,AD治疗前景的严峻性和紧迫性日益突出,学者的目光开始重新回到AD相关机制的基础研究,期望为AD的治疗寻求突破。AD患者脑内最具特点的组织学变化包含由神经细胞内Tau蛋白异常磷酸化导致的神经纤维缠结(neurofibrillary tangle,NFT)、细胞间质内Aβ异常聚集和大量沉淀形成的老年斑(senile plaque,SP)、皮层和海马等重要脑区内的大量神经元退化丢失,除此之外,神经突触的功能障碍也是AD病理发生中一个重要因素。参与AD发病机制和疾病进程的因素较多,不可干预因素方面有老龄化等,其他方面有遗传因素、环境因素、炎症等因素,而高血压和糖尿病等也是影响AD进程的重要因素。研究较多的神经营养素——脑源性神经营养因子(BDNF)具有非常重要的作用。我们认为,BDNF在脑内的酶解转化异常和含量水平异常可能与AD的发病和进展有重要关系。已有研究发现,AD病人往往伴随脑内外BDNF水平的改变,并有假设提出将BDNF作为预测AD的生物学标记物,但这种假设有待于更多的研究来证实。近年学者发现,作为BDNF前体蛋白的脑源性神经营养因子前体(brain-derived neurotrophic factor precursor,pro BDNF),其本身也具有生物活性,能够影响神经细胞的多项生物功能。离体和在体实验表明,pro BDNF具有与其裂解产物成熟体BDNF(mature BDNF,m BDNF)不同甚至相反的生物学作用,能够通过p75神经营养素受体(p75 neurotrophin receptor,p75NTR)等机制介导对神经细胞的毒性作用,引发神经突触功能障碍,甚至导致细胞凋亡。目前认为,由前体蛋白的酶裂解转化异常等原因导致的pro BDNF/m BDNF比例失衡可能突显了pro BDNF的负性生物学效应,进而引发pro BDNF的各种神经毒性作用。因此,深入研究pro BDNF对神经细胞存活及其轴突的影响具有重要意义。Aβ是构成SP的主要成分,脑内Aβ的代谢异常和异常沉积被认为是AD发病机制中的始发因素和中心环节。目前认为,大量Aβ异常沉积产生神经毒性,还可促发神经细胞反应性产生Aβ,最终导致Aβ的产生与清除失衡,形成恶性循环。当皮层和海马等区域出现大量Aβ沉积及老年斑形成时,神经元往往出现凋亡和丢失,进而引发一系列高级认知功能的损害,即AD常见的记忆力减退、精神行为功能异常等表现。因此,如何能够在维持神经细胞功能的同时终止或减缓Aβ的继续沉积是防治AD进展的一个重要环节。由于血脑屏障对多种药物的屏蔽作用,关于AD相关神经毒性的研究大多局限于离体条件下。采用脑内或脑室内立体定向注射技术能够准确将干预药物递送至脑内,有效观察在体情况下脑内的病理变化进程。研究表明,脑内或脑室内给予重组病毒等基因载体能够有效转导神经细胞并表达,或给予低免疫原性抗体等外源性物质可被神经细胞有效摄取和逆向转运。因此,我们在本研究中采用重组抗裂解的pro BDNF以及能够表达此重组蛋白的腺相关病毒基因整合载体(adeno-associated virus-pro BDNF,AAV-pro BDNF),以及脑内Aβ沉积增加并即将出现行为学改变的适龄转基因阿尔茨海默病小鼠(AD鼠,雌性,5月龄,APPswe PS1d E9):1.观察离体情况下pro BDNF对神经元存活和突起生长的影响,探讨p75NTR在其中可能的介导作用;2.建立侧脑室立体定向注射方法,检测AAV-pro BDNF注射后不同时期重组pro BDNF蛋白在AD鼠脑内的表达情况;3.研究在体情况下pro BDNF对AD鼠学习记忆功能和脑内Aβ代谢的影响,以及p75NTR在其中可能的介导作用。一、材料和方法1.对p75NTR转基因小鼠(129sv背景)进行基因型鉴定,通过同种基因型的小鼠交配获得野生型(p75NTR+/+)或基因敲除型(p75NTR-/-)的纯合子胎鼠,分别用于后续实验。①新生海马神经元存活实验:采用18日龄的纯合子胎鼠(p75NTR+/+型或p75NTR-/-型)进行新生海马神经元的原代培养,设定不同浓度(0,10,30,100ng/ml)的重组抗裂解pro BDNF进行干预,24h后MTT法测定特定波长下(570nm)光密度值(OD);其后观察在一定浓度的pro BDNF(30ng/ml)下给予不同浓度(0,10,30,100μg/ml)的p75NTR胞外段与人Ig G Fc段融合蛋白(p75/Fc,p75NTR竞争性抑制剂)20h后MTT法测定570nm处OD值,从而了解神经元凋亡情况。②神经元轴突生长实验:分别采用人神经母细胞瘤细胞株(SH-SY5Y)和原代培养的新生皮层神经元(p75NTR+/+和p75NTR-/-),给予30ng/ml的pro BDNF干预,72h后通过结晶紫染色或免疫荧光染色显示并测算两种神经元轴突长度;同时观察加用30μg/ml p75/Fc后各组神经元轴突长度变化情况。2.采用转基因阿尔茨海默病模型小鼠(AD鼠,APPswePS1d E9,雌性,5月龄)进行立体定位下侧脑室微量注射0.1%溴酚蓝(4μl),24h后取脑鉴定脑室内扩散情况。随后同样方法注射AAV-pro BDNF(8×1010vg,4μl)或生理盐水(4μl,对照),术后4周和8周分别采用酶联免疫吸附检测(ELISA)检测鼠脑内pro BDNF蛋白表达水平。3.采用AD鼠(APPswePS1d E9,雌性,5月龄),立体定位下侧脑室内注射生理盐水(NS)、AAV-pro BDNF(8×1010vg)、AAV-pro BDNF和小鼠源性p75NTR单克隆抗体(AAV-pro BDNF 8×1010vg+Anti-p75Ab 0.6μg),术后8周采用Morris水迷宫方法检测AD鼠学习记忆功能变化。4.采用ELISA法检测AD鼠脑内Aβ40、Aβ42并计算Aβ总水平;应用免疫组织化学(6E10)和刚果红(Congo red)染色方法显示脑内Aβ沉积和老年斑形成情况,并统计老年斑数量。二、结果1.pro BDNF对新生神经元的存活有抑制作用,且随pro BDNF的浓度升高其抑制作用增强,在30ng/ml时出现抑制效应较为明显(P﹤0.05);pro BDNF对新生神经元存活的抑制作用随p75/Fc浓度的升高而减弱。pro BDNF(30ng/ml)能够抑制激活后的SH-SY5Y和新生海马神经元的轴突生长,而p75/Fc(100μg/ml)能够中和这种抑制效应。pro BDNF对p75NTR-/-型神经元的存活和轴突生长未显示出明显影响(P﹥0.05)。2.在采用0.1%溴酚蓝进行AD鼠侧脑室定向注射24h后,取脑证实溴酚蓝在脑室系统内广泛扩散。随后进行侧脑室注射AAV-pro BDNF,ELISA检测结果显示,4周和8周鼠脑内pro BDNF表达水平较注射前明显增加(4周时达高峰),显著高于同时期假手术对照组,差异均具有统计学意义(P﹤0.05),说明AAV-pro BDNF经侧脑室注射后在8周内脑内pro BDNF均有明显表达。3.Morris水迷宫显示,在定位巡航试验的获得性训练中三组小鼠间的巡航速度无明显差异(P﹥0.05);AAV-pro BDNF组AD鼠在训练后其逃避潜伏期未出现明显下降,在训练末期明显高于假手术对照组,差异具有统计学意义(P﹤0.05)。在空间探索试验中,AAV-pro BDNF组的AD鼠在目标象限内的时间与假手术对照组相比明显缩短,差异具有统计学意义(P﹤0.05)。而AAV-pro BDNF+Anti-p75Ab组AD鼠在逃避潜伏期及在目标象限内时间与假手术对照组比较无明显差异(P﹥0.05)。4.AAV-pro BDNF组AD鼠脑内Aβ水平高于对照组(P﹤0.05)。AAV-pro BDNF+Anti-p75Ab组AD鼠脑内Aβ水平高于对照组,但低于AAV-pro BDNF组,差异均有统计学意义(P﹤0.05)。同样,AAV-pro BDNF组AD鼠脑内老年斑数量相对于对照组明显增加,差异有统计学意义(P﹤0.05),而AAV-pro BDNF+Anti-p75Ab组AD鼠脑内老年斑数量介于上述两组之间,具有均统计学差异(P﹤0.05)。三、结论1.pro BDNF对培养神经元的存活和轴突生长有抑制作用,且这种作用可能是通过受体p75NTR介导产生。2.pro BDNF可能通过p75NTR的介导增加AD鼠脑内Aβ产生和异常沉积,并因此加剧AD小鼠学习记忆功能的损害。