研究背景:乳腺癌是世界范围内女性最好发的恶性肿瘤,并且是女性癌因性死亡的第二大疾病。引发患者死亡的最主要原因是肿瘤细胞的转移。最新的研究发现许多恶性肿瘤患者会出现血液高凝状态,这种血液高凝状态会增加患者转移和术后复发的风险。纵观肿瘤微环境,血小板在形成血液高凝状态和促进肿瘤血行转移中发挥着重要作用。活化的血小板可以与肿瘤细胞形成复合物,保护血管中的肿瘤细胞免于被高剪切血流和宿主免疫系统消除,这将有利于肿瘤细胞粘附到血管的内皮细胞并外渗。此外,肿瘤细胞可以刺激血小板活化,肿瘤细胞表面和血小板细胞膜上的整合蛋白integrins以受体和配体的形式相结合,促进肿瘤细胞和血小板之间的粘附。整合蛋白是由在血小板中大量表达的非共价连接的α和β亚基组成的跨膜粘附受体家族。在乳腺癌中,β 3和β1整合蛋白的表达已经被研究证实支持血小板与肿瘤细胞的相互作用,允许肿瘤细胞粘附到脉管系统并由此转移。因此,下调血小板活化可能是缓解血液高凝状态和抑制肿瘤转移的有效策略。目前的抗血小板药物如肝素和阿司匹林被证实是通过消耗全身血小板来显示出对肿瘤转移的治疗功效。然而,这种治疗策略具有临床局限性,因为这一治疗策略与一些并发症例如胃肠出血和出血性中风相关,特别是在由于化疗或放射治疗已经出现血小板减少的患者中。因此,应该研究更安全同时保证有效的抗血小板药。化瘀丸是以"益气活血解毒"为治则组成的中药方剂,用于防治恶性肿瘤,并在临床中显示出抗肿瘤效果。化瘀丸的药理学研究显示,姜黄素是化瘀丸中单体成分之一。从植物中提取的姜黄素是对人没有显著毒性的自然界的化合物,并已应用在各种病症的防治中。越来越多的证据表明姜黄素是一种高度多效的分子,具有不同的生物活性。虽然广泛的研究表明姜黄素具有抗肿瘤作用,但其抗转移效能和基础机制几乎没有报告。实验方法:体外实验:我们采用MTT法、ECIS细胞动态分析仪来研究中药复方化瘀丸、中药单体姜黄素对4T1乳腺癌细胞增殖的影响。划痕实验和电击损伤修复实验检测HYW含药血清、姜黄素对4T1乳腺癌细胞迁移、损伤修复能力的影响。采用Western blot的方法检测在4T1细胞总蛋白中MAPK信号通路和PI3K信号通路蛋白的表达量。体内实验:建立乳腺癌原位移植瘤小鼠模型,分别给予化瘀丸、姜黄素口服干预,检测肿瘤体积、重量、生物发光情况,并检测肺转移灶的面积、个数,肺重,来观察化瘀丸及姜黄素对原位瘤和转移瘤的干预作用。凝血四项中检测APTT、PT、Fbg,血小板计数来检测治疗后血小板个数的改变。血栓弹力图检测血小板功能。流式细胞术检测血小板活化和凋亡。Western blot检测肿瘤组织中整合蛋白integrins的表达。实验结果:MTT法、ECIS细胞动态分析仪均证明HYW含药血清、姜黄素对4T1细胞有增殖抑制作用,并且这种抑制作用呈现出剂量依赖和时间依赖。ECIS细胞电击损伤实验证实各浓度HYW含药血清、Cur-luM组、Cur-1OuM组和Cur-30uM组姜黄素对4T1细胞的运动迁移能力有明显的抑制作用。我们检测了 MAPK通路中P38蛋白和ERK蛋白的表达,同时检测了磷酸化的P38蛋白和磷酸化的ERK蛋白的表达,发现与空白对照组相比,化瘀丸组和姜黄素组的磷酸化的P38蛋白和磷酸化的ERK蛋白表达量明显下降。我们检测了 PI3K通路中PI3K蛋白和AKT蛋白的表达,同时检测了磷酸化的PI3K蛋白和磷酸化的AKT蛋白的表达,与空白对照组相比,化瘀丸组和姜黄素组的磷酸化的PI3K蛋白和磷酸化的AKT蛋白表达量明显下降。我们用4T1乳腺癌细胞和BALB/C小鼠建立了小鼠乳垫原位移植瘤模型,给予不同剂量化瘀丸和不同剂量姜黄素治疗。小动物活体成像技术实验结果表明连续给药3周后,HYW-L与和HYW-H均能降低原位肿瘤的光子数,然而,HYW-L只表现出抑制肿瘤生长的趋势,并无统计学差异。HYW-H组对肿瘤的光子数的影响有统计学差异。牺牲小鼠取得肿瘤后,称量肿瘤重量,结果与小动物成像仪所得结果相一致,HYW-H表现出良好的抑瘤效果。连续给药21天,每周2次应用游标卡尺测量肿瘤长径(length)和短径(width),按照公式计算肿瘤体积。根据肿瘤体积绘制生长曲线,随给药时间的延续动态观察各组小鼠肿瘤体积的变化趋势。HYW-L组和HYW-H组原位肿瘤的瘤体积的增长持续低于模型组。牺牲小鼠后取小鼠完整肺脏,称重记录,治疗组肺重低于模型组,肺转移灶面积和肺转移灶个数低于模型组。HYW组和Cur组治疗后PLT并未发现改变。模型组小鼠和正常小鼠相比,PT明显下降,表明乳腺癌荷瘤小鼠血液处于高凝状态。经过化瘀丸、姜黄素治疗后,荷瘤小鼠PT上升,与模型组相比有明显差异。模型组小鼠和正常小鼠相比,APPT明显下降,表明乳腺癌荷瘤小鼠血液处于高凝状态。经过化瘀丸、姜黄素分别治疗后,荷瘤小鼠APPT上升,并且APTT的上升随着姜黄素剂量的增加而增加。血栓弹力图结果显示,与正常小鼠相比,负荷肿瘤的小鼠显示出较短的R时间,表明血凝过快,有统计学差异(P<0.05)。与对照组相比,化瘀丸、姜黄素治疗组的R时间增加。MA值振幅的成对比较显示正常组和对照组之间的显着差异(P<0.05)。通过呈现高MA值,我们在荷瘤小鼠中观察到血小板功能亢进导致的高凝状态。用不同浓度的化瘀丸、姜黄素治疗,结果显示化瘀丸、姜黄素可以以剂量依赖的方式降低荷瘤小鼠血液中血小板的功能亢进。通过流式细胞术分析,我们发现化瘀丸、姜黄素可以在很大程度上抑制血小板中的P-选择素表达。用不同浓度的化瘀丸,姜黄素治疗肿瘤负荷的小鼠,导致凋亡的血小板比例以剂量依赖性方式增加。化瘀丸及其单体成分姜黄素对肿瘤组织中与细胞粘附分子相关的整合蛋白integrin β1 和 integrin β3 有下调作用。结论:体内实验证实化瘀丸及其单体成分姜黄素能有效地抑制乳腺癌4T1细胞的增殖和转移。体内试验证实化瘀丸及其单体成分姜黄素有效地缓解了乳腺癌荷瘤小鼠的血液高凝状态,原位肿瘤和肺转移也得到了一定程度的抑制。进一步探索机制,化瘀丸及姜黄素通过降低血液高凝状态,抑制血小板活化,下调β1和β3整联蛋白的表达,减弱肿瘤细胞和血小板之间的相互作用,从而抑制肿瘤转移。