嗅觉是动物感知外界的重要感知,在寻找食物、进行群体间交流、地理定位等行为中起到一定的作用。嗅觉功能的实现是基于嗅觉受体(olfactory receptors,OR)蛋白功能的实施,OR具有能够识别并结合外界气味分子的功能,此是引发嗅觉功能的起始阶段。经过长时间的进化,OR具有5个相互独立的家族,其中的主嗅觉受体(main olfactory receptors,MORs)在数量上是最多的,并且具有识别、结合能够溶于水的气味分子。MOR蛋白由MOR基因表达,在此研究中刀鲚(Coilia nasus)的OR基因MOR-4K13和MOR-51I2属于MOR基因,预测基因编码的OR具有7次α-螺旋跨膜结构,是G-蛋白偶联受体(G-protein coupled receptors,GPCRs)超家族中的一员。已报道的研究认为嗅觉功能在鱼类洄游行为中起到一定的作用,研究对象刀鲚具有两种生态型:洄游型和定居型,其中洄游行为为生殖洄游。本研究就刀鲚OR基因的克隆、基因结构、生物信息学分析、组织表达、系统进化和不同生态型OR间氨基酸序列的差异及系统进化关系等方便进行分析。为后续研究影响刀鲚洄游行为因素、洄游“嗅觉定向假说”和“嗅觉印记”等理论提供有用数据。1.刀鲚MOR-4K13基因的克隆及组织表达。采用cDNA末端快速扩增技术(rapid amplification of cDNA ends,RACE)从洄游型靖江刀鲚嗅囊中获得了MOR-4K13基因,获得基因的长度为1098bp,具有963bp的开放阅读框区域,位置在获得基因51~1013bp范围内,单外显子结构,预测可编码320个氨基酸。预测MOR-4K13基因编码的氨基酸序列,可以形成7次α-螺旋跨膜结构,属GPCRs家族A,有胆固醇(cholesterol)和油酸(oleic acid)两个天然配体,无信号肽结构,为非分泌蛋白,有一个二硫键结构,能够被22个色氨酸(serine,S)激酶、27个苏氨酸(threonine,T)激酶、17个酪氨酸(tyrosine,Y)激酶磷酸化修饰位点;同时具有8个protein类、5个DNA类和5个RNA类绑定位点。MOR-4K13蛋白是细胞质膜组分,镶嵌与质膜内,部分结构位于细胞外围,同时具有跨膜信号受体、GPCRs、信号传导、分子传导、OR等活性,并且参与感觉化学气味分子、信号传导、细胞通讯、监管生化过程、刺激细胞反应、调节细胞、多细胞生物过程、生物调节等过程。序列同源性比较显示,刀鲚mor-4k13基因编码区序列与已报道的其他鱼类or基因的同源性在65%~84%间,其预测编码的蛋白与其他鱼类or蛋白的同源性在40%~68%,与近缘种大西洋鲱(clupeaharengus)or4k13-like基因及编码的蛋白同源性分别为77%和68%。在进化树上两者进化距离最近,处于同一小分支,在进化距离上与鲑形目、鳉形目、雀鳝目、鲀形目及鲽形目中鱼类or基因及编码的蛋白质较远。qrt-pcr分析显示,mor-4k13基因在定居型鄱阳湖刀鲚嗅囊和性腺中高表达,在肌肉、眼球、胃壁、肝脏和鳃中低表达,心脏中几乎不表达。洄游型靖江刀鲚嗅囊中的表达量总体高于定居型鄱阳湖刀鲚。这表明mor-4k13基因不仅与嗅觉功能和性腺发育相关,也可能与生殖洄游习性相关,不同性别的个体间也存在着嗅觉能力的差异。2.刀鲚mor-51i2基因克隆及组织表达。利用染色体步移技术从洄游型靖江刀鲚体内克隆一条能够编码嗅觉受体蛋白的基因序列,命名为mor-51i2基因。该基因为单外显子结构,开放阅读框区域长999bp,在3′-utr区域具有微卫星序列,以(ac)n为重复单位,但其中夹有若干t或g碱基,在不同种群中具有长度差异。mor-51i2基因能够编码332个氨基酸残基,同样能够形成7次α-螺旋跨膜结构,属gpcrs家族a,具有一个二硫键结构,并无信号肽结构,具有被22个色氨酸(s)激酶、25个苏氨酸(t)激酶、17个酪氨酸(y)激酶激酶磷酸化位点,有9个protein类、6个dna类和7个rna绑定位点,mor-51i2基因产物是细胞质膜组分,镶嵌与质膜内,部分结构位于细胞外围,具有跨膜信号受体、gpcrs、信号传导、分子传导、or等活性。刀鲚mor-51i2基因序列与已经报道过的其他鱼类同源基因的同源性在66-85%之间,mor-51i2蛋白与已报道的其他鱼类or蛋白的同源性在51%以上,其中与同为鲱形目的大西洋鲱(c.harengus)or51i2-like基因及蛋白同源性最高,在系统进化关系上两者最近处于同一分支。qrt-pcr分析显示,mor-51i2基因在定居型鄱阳湖刀鲚中主要在嗅囊和性腺中表达,而在胃、肝脏、鳃、肌肉、心脏和眼睛中几乎不表达。其中,雌性嗅囊中的表达量约是其雄性嗅囊中的2倍,但洄游型靖江刀鲚嗅囊表达量总体上高于定居型鄱阳湖嗅囊,这些结果表明,mor-51i2基因不但与嗅觉功能有关,也可能参与了刀鲚的性腺发育及生殖洄游过程,同时也可能与生态型的分化相关。