第一章:正常小鼠围排卵期卵丘颗粒细胞-卵子复合物(COC)脂质存在状态　　 目的：系统性描述生理状态下围排卵期小鼠卵巢组织中的脂质存在状态；COC内脂滴相关蛋白表达；COC内脂滴含量动态变化及脂质代谢相关基因表达差异。　　 内容与方法：　　 1.免疫组织化学方法检测围排卵期卵巢组织中载脂蛋白Apo—A1及Apo—B,定性细胞外脂质存在状态；　　 2.免疫荧光染色共定位载脂蛋白Apo—B与卵丘颗粒细胞骨架蛋白-透明质酸酶结合蛋白(HABP),定位细胞外脂质分布；　　 3.使用两类亲脂性染料-BODIPY及Nile Red,定性及半定量测定COC内脂质含量及分布动态变化；　　 4.免疫组织化学检测PAT及CIDE两大类脂质相关蛋白家族成员在卵巢组织中表达；　　 5.免疫荧光共定位ADRP及脂滴在COC中表达,半定量COC内ADRP蛋白表达,Realtime-PCR测定COC内ADRP基因表达；　　 6.Taqman Array96一well plate IP/N4415461)检测小鼠未成熟及成熟COC内脂质代谢相关基因表达(44个)。　　 结果：　　 1.Apo—A1及Apo—B在小鼠卵巢组织中的免疫组织化学染色揭示在排卵周期中脂蛋白存在于卵子及其周围颗粒细胞中。在排卵hCG刺激之前低水平表达,而排卵刺激6h之后在卵泡窦腔内表达大量的增加,接近排卵时(hCG后12h)达到最高峰值。排卵之后仍可在输卵管内检测到载脂蛋白包裹在卵子周围；　　 2.Apo-B在卵泡窦腔内持续表达,hCG刺激后呈现增加趋势；HABP在排卵hCG刺激后出现。Apo—B与HABP表达共定位表明载脂蛋白锚定于卵丘颗粒细胞骨架蛋白之上,为卵丘颗粒细胞的生长、扩张、植入过程提供脂质能量来源,进而为卵子的成熟、受精、卵裂提供能量成为可能；　　 3.两类特异性亲脂荧光染料对小鼠围排卵期COC内脂滴表达进行定位,半定量分析表明两种染色结果类似。脂滴存在于排卵前后的小鼠卵子以及卵丘颗粒细胞的胞浆内。脂滴在未成熟的小鼠卵子内均匀分布,而在hCG峰后,脂滴转化成为大的块状颗粒,聚集于卵胞浆内。脂滴的半定量分析得出,排卵峰出现后小鼠卵子体积缩小脂滴重新分布,呈团块状聚集于胞浆内,脂质含量增加；　　 4.免疫组织化学检测PAT及CIDE两大类脂质相关蛋白家族表达。在整个围排卵期的卵巢组织内,ADRP广泛分布于卵泡膜细胞、壁层颗粒细胞、卵丘颗粒细胞,以及分布于从次级卵泡至窦腔卵泡之间的所有卵子内。hCG刺激之前,ADRP均质分布于卵子内,随着排卵峰值出现,ADRP聚集呈点状,散在分布。Perilipin在卵泡膜细胞中持续高表达,在卵泡壁层颗粒细胞及COC中的表达相对较低,排卵峰值的刺激对其表达量无明显影响。CIDE-A及CIDE-B均表达于卵巢组织内,在较小的次级卵泡中表达量较高,随着卵泡生长,其表达量呈现下降趋势；　　 5.ADRP与BODIPY在COC内呈现共定位表达,而且与光镜下卵子内脂滴黑色颗粒位置一致。表明ADRP即为COC内的脂滴包裹蛋白。ADRP蛋白及mRNA表达在排卵后均显著增加；　　 6.所检小鼠COC测脂质代谢相关基因共44个。在成熟过程中36个脂类代谢途径中的关键酶基因表达发生显著变化。由于成熟后小鼠COC较未成熟COC内含有显著增加的细胞内脂滴含量,因此甘油三酯、胆固醇、脂肪酸等合成关键酶类的基因表达降低,细胞摄取受体减少,线粒体酶活性降低,而磷脂分解代谢增强,其下游产物如各类前列腺素、血栓烷A类、白介素及炎症性细胞因子等合成基因表达增强。而已有研究表明这些炎症介质对于正常的卵子成熟及排卵过程具有重要作用。PPARgamma基因作为细胞内脂质代谢调控基因,在小鼠COC中也起到重要的作用,所检测的44个基因多数已证明为PPAR调控基因,由此而得出假设:PPARgamma可能是小鼠COC内各类脂质代谢的总调控者,在小鼠COC成熟过程中综合调控各类基因表达以使COC具有充足的甘油三酯为COC排卵及后续受精提供能量储备,多量的磷脂提供受精后的卵裂过程所需的细胞膜,同时磷脂的各类代谢产物也是正常卵子发育及排卵过程的保障,而多量的游离胆固醇则是各种类固醇激素合成的前体物质。　　 结论：　　 1.载脂蛋白Apo—A1以及Apo—B均表达于小鼠围排卵期卵巢组织内,结合于卵丘颗粒细胞结构蛋白,包裹在卵子周围,其表达量在靠近排卵时尤为增高,是卵子生长过程细胞外脂质供应来源；　　 2.小鼠围排卵期卵子及颗粒细胞中存在着细胞内脂滴储备。脂滴呈均质分布于卵胞浆内,而在排卵峰出现后,伴随着GVBD以及第一极体的排出,胞浆结构重塑,脂滴分布模式发生动态变化,大量的脂滴形成大颗粒状,聚集于卵子中央,同时伴随卵子体积缩小；　　 3.ADRP蛋白在围排卵期卵巢组织中的表达呈现动态变化,在未成熟卵子内呈均质表达,逐渐变成为成熟卵子中点状聚集,散在分布。成熟COC内ADRP蛋白及mRNA表达量增加。ADRP是COC内包裹脂滴的调节蛋白。Perilipin在卵泡膜细胞中特异高表达,推断其在卵巢组织中的作用类似于在其他类固醇激素分泌的细胞(如肾上腺皮质,leydig细胞等),调节卵巢组织内类固醇激素类的合成、分泌。CIDE家族的表达随着卵泡发育周期表达量降低,其中的作用机制尚不明确；　　 4.脂质代谢调节相关基因差异表达揭示,PPARgamma作为小鼠COC内脂类代谢总调控基因,促使COC在成熟过程中大量储集甘油三酯、游离胆固醇及脂肪酸。为排卵、受精及卵裂过程及类固醇激素合成提供重要的能量来源及合成前体。各种脂类的摄取、合成、代谢及释放通路相互配合协调,呈动态平衡状态。　　 第二章:高脂饮食对小鼠围排卵期卵丘颗粒细胞-卵子复合物脂质代谢及细胞器功能影响　　 目的：揭示高脂饮食对小鼠围排卵期COC内脂质含量及脂质相关蛋白表达影响；明确增加的脂肪含量所诱导的细胞脂毒性反应(线粒体内膜电位,内质网应激,细胞凋亡)的发生；检测高脂饮食对COC内脂质代谢相关基因表达影响。　　 内容与方法：　　 1.肥胖小鼠模型建立:5周龄CBA小鼠以21％脂肪的高脂饮食(High Fat Diet,HFD)或对照饮食(control Diet,CD)饲养4周。称量体重,取血清检测血糖、胰岛素、甘油三酯及胆固醇水平；　　 2.特异性亲脂性染料BODIPY对饮食干预后HFD组和CD组COC内脂质含量半定量分析；　　 3.免疫组织化学检测HFD组与CD组卵巢组织内ADRP表达量,Real—time PCR检测该基因表达状况；　　 4.HFD组及CD组COC内线粒体内膜电位JC-1染色；　　 5.Real-time PCR检测两组COC及壁层颗粒细胞中内质网应激基因(GRP78,ATF4以及CHOP10)表达；　　 6.壁层颗粒细胞DNA碎片ladder,180bp及360bp条带强度半定量；　　 7.卵巢组织TUNEL染色,凋亡细胞计数计算凋亡指数;　　 8.Taqman Array96-well plate(P/N4415461)检测高脂饮食组与对照饮食组小鼠成熟COC内脂质代谢相关基因表达差异(44个)。　　 结果：　　 1.4周高脂饮食后小鼠体重增加2g,血清学检测表明小鼠具有高脂蛋白血症及高血糖症;　　 2.4周饮食干预后,HFD组未成熟卵子内脂肪含量较CD组明显增加,而hOG刺激之后的脂肪含量出现更进一步的显著增加(P<0.0001)。饮食干预直接增加卵巢内生长发育成熟过程中的卵子内脂肪含量,卵子体积增大(P=0.045)；　　 3.COC中JC-1染色测定线粒体内膜电位,明确了HFD对小鼠卵子胞浆内线粒体损伤作用。在对照组卵子中,高膜电位线粒体出现在卵泡浆周边区域(红色),而较低电位的线粒体分布于卵泡浆中央区域(绿色)。在高脂饮食小鼠卵子中,周边区域的红色荧光强度减弱,较广泛地分布于卵泡浆内。而绿色荧光呈现增加趋势聚集于卵胞浆内(线粒体损伤最早即表现为线粒体膜极性下降,红色及绿色荧光比例代表细胞内的膜极性状态,该比值的减少是线粒体损伤的标志)。对照组未成熟小鼠卵子JC-1染色后红/绿荧光强度比值为0.82±0.04,成熟后比值降低为0.61±0.06(P=0.01)。高脂饲料喂养四周后,成熟及未成熟卵子红色/绿色荧光比值均减少,未成熟卵子比值为0.59±0.05(P=0.002),成熟卵子比值为0.38±0.05(P=0.01)；　　 4.为了明确高脂饮食对小鼠卵子胞浆中内质网功能的影响,分别测定了COC以及壁层颗粒细胞中内质网应激基因的表达量,包括GRP78、ATF4以及CHOP10。(GRP78是最常用的内质网应激的生物学标志；ATF4蛋白是一种转录因子,调节unfolded protein response反应中数种基因的启动子；cHOP10是另外一种ER应激的反应蛋白)。实验发现高脂饮食促使小鼠COC中GRP78和ATF4基因表达增加,颗粒细胞的GRP78表达也增加。CHOP10表达量未受到饮食干预影响,在两组中的表达量相当；　　 5.检测小鼠卵巢组织中颗粒细胞及COC内的细胞凋亡状态。DNA ladder分析显示颗粒细胞内180bp及360bp细胞条带强度较对照组增加,表明DNA破碎程度增加。卵巢组织切片TUNEL染色显示HFD卵巢组织中显著增加的TUNEL阳性染色细胞。HFD组凋亡指数在COC中为44.03‰,壁层颗粒细胞中为31.83‰；正常饮食小鼠COC中凋亡指数为7.6‰,壁层颗粒细胞中为7.65‰(P<0.001)；　　 6.脂类代谢相关基因检测表明,高脂饮食在多方面影响COC内脂质代谢。包括长链不饱和脂肪酸生成、胆固醇生成、磷脂代谢、白介素、细胞因子生成以及线粒体代谢酶类。这些异常的代谢途径均可能是进一步影响卵子质量的关键因素。　　 结论：　　 1.使用4周HFD方法建立小鼠肥胖模型,小鼠体重显著增加2g(P<0.01)。各项脂类代谢内分泌指标表明小鼠出现高脂血症倾向,类似于肥胖人群,肥胖模型建立成功；　　 2.4周HFD可显著促进小鼠未成熟及成熟COC内脂滴募集,脂肪含量增加；　　 3.4周HFD促使小鼠卵子内线粒体膜电位降低,显示小鼠卵子线粒体损伤；　　 4.HFD可促使小鼠COC及壁层颗粒细胞内ER stress基因表达增强；　　 5.脂类囤积,ERstress,线粒体损伤等脂毒性反应可最终导致细胞DNA碎裂,加剧HFD小鼠COC细胞凋亡过程；　　 6.HFD显著影响COC内正常脂质代谢基因的平衡状态,由此可最终影响卵子质量。　　 第三章异常的内分泌环境对体外培养未成熟小鼠卵子脂质代谢影响　　 目的：评估两类最常用的体外培养体系对小鼠卵子体外成熟过程脂类募集影响；肥胖患者卵泡液,正常体重患者卵泡液对小鼠体外成熟COC脂肪含量脂蛋白基因表达及内质网应激基因表达影响；模拟异常内分泌的体外培养环境(高胰岛素,高雄激素,不同长度碳链脂肪酸)对体外成熟小鼠卵子内脂肪含量影响。　　 内容与方法：　　 1.采用最常用的体外培养成熟系统:基于3mg/ml无自由脂肪酸的牛血清白蛋白(Bovine serum albumin,BSA)或基于5％胎牛血清(Fetal calf serum,FCS),体外成熟COC行脂肪染色及卵子成熟度评估；　　 2.50％体积比添加人类卵泡液用于小鼠COC体外培养成熟。行脂肪染色及卵子成熟度评估:Real—time PCR用于半定量COC内ADRP及ER应激基因表达；luminax检测卵泡液中载脂蛋白及慢性炎症因子水平；　　 3.小鼠未成熟卵子体外培养:胰岛素浓度梯度0μg/ml,0.052μg/ml,0.26μg/ml,1.3μg/ml,6.9μg/ml。睾酮浓度梯度0nmol/L,200nmol/L,1000nmol/L、及5000nmol/L。各类脂肪酸浓度50nmol/L。行脂肪染色及卵子成熟度评估。　　 结果：　　 1.体外培养成熟系统中添加生长因子(EGF及FSH)可显著促进COC内脂滴募集,5％FCS培养环境可进一步促进COC脂滴含量增加。BSA内培养成熟卵子内脂肪含量与在体成熟卵子水平一致,差异无统计学意义；　　 2.虽然肥胖患者及对照患者卵泡液均未影响小鼠COC的卵丘颗粒细胞扩张,但肥胖组卵泡液含有显著增加的炎症性细胞因子IL-6,IL-10,Leptin及载脂蛋白AⅠ,AⅡ,可显著增加卵子内脂肪含量,阻断小鼠卵子第一极体排出过程,卵子成熟率明显降低,同时伴有COC内ER应激基因表达增强。正常患者卵泡液作为小鼠COC体外培养环境,对COC内脂滴含量及ADRP基因表达影响与在体成熟COC一致;　　 3.胰岛素:依据生理状态下卵泡液内胰岛素浓度水平制定浓度梯度,体外培养添加外源性的胰岛素并未影响COC扩张或卵子第一极体排出过程,COC内脂肪含量测定亦未发现各浓度对于卵子内脂肪含量影响；睾酮:浓度大于1000nmol/L睾酮明显阻碍卵子生殖泡降解过程及第一极体排出,卵丘颗粒细胞扩张程度受抑制,卵子成熟过程受到阻碍导致该组卵子内脂肪含量相应减少；不同长度碳链脂肪酸:实验选用碳链长度介于8至18的饱和脂肪酸,以及C18单不饱和脂肪酸。用于比较不同长度碳链脂肪酸及脂肪酸饱和程度对于卵子内脂肪含量影响。结果表明卵子对于不同碳链长度脂肪酸的摄取具有选择性。长度为16碳的Palmitic较其他脂肪酸更显著性促进卵子内的脂滴募集,不饱和脂肪酸并未明显增加卵子内脂滴含量。　　 结论：　　 1.比较BSA及FCS两类最常用的体外培养成熟系统对于维持小鼠卵子正常脂肪动态变化方面的优劣,BSA内成熟卵子内脂滴含量与在体成熟卵子较一致,而FCS则显著促进了卵子内脂滴的募集过程；　　 2.患者卵泡液内甘油三酯(TG),脂肪酸(FFA)及亚急性炎症因子水平为机体内分泌环境的直接反映。肥胖患者卵泡液内显著增加的TG,FFA,载脂蛋白A及炎症细胞因子(IL-6,IL-10及leptin)可显著抑制体外培养成熟的小鼠卵子第一极体排出,影响卵子成熟；同时卵子内脂肪含量及ADRP表达显著增加伴有ER应激基因的表达增强；　　 3.外源性添加胰岛素未发现对小鼠卵子内脂肪含量影响；浓度大于1000nmol/L睾酮明显阻碍卵子GVBD过程及第一极体排出,COC扩张程度抑制,卵子内脂肪含量相应减少；卵子对于不同碳链长度脂肪酸的摄取具有选择性,长度为16碳的Palmitic较其他脂肪酸可显著性增加卵子内的脂肪含量。由此推及多囊卵巢综合征患者卵泡液内异常的雄激素活性也可能会扰乱患者卵子中脂质正常代谢过程进而影响卵子质量。