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目的:作为造血干细胞的新来源,脐血以其独特的优势已广泛应用于移植治疗、生物免疫治疗、基因治疗等领域。但由于单份脐血的采集量低,不足以满足成人移植的需要,长期以来,研究者们一直在探索脐血干/祖细胞的有效分离、扩增的方法。本课题旨在寻求一种简便、高效、实用的脐血干/祖细胞的分离方法,并且对分离后的细胞进行体外扩增,来考察分离后的脐血干/祖细胞的增殖能力,探索扩增后最佳的应用时机;同时,比较有血清与无血清方法体外扩增脐血干/祖细胞的异同,探究无血清方法临床应用的可能性。方法:体外分离并培养脐血单个核细胞(MNC),计数MNC总数、流式细胞仪检测CD34+细胞含量、混合集落生成单位(CFU-mix)培养观察集落形成能力,验证脐血干/祖细胞分离和扩增的效果。1.将自行配制的比重为1.064g/L的蔗聚糖-泛影葡胺(Ficoll-hypaque)分离液与传统的比重为1.077g/L淋巴细胞分离液密度梯度分离脐血,检测上述指标,比较分离效果;2.用上述两种分离液分离的脐血MNC进行添加细胞因子(IL-3、SCF、GM-CSF)的为期三周的体外扩增,并对扩增后的细胞进行上述指标的检测,观察每周脐血干/祖细胞的增殖、分化情况。3.采用比重为1.064g/L的分离液分离的脐血MNC,用无血清造血干细胞培养体系和传统的含马血清的培养体系,进行三周的体外扩增,检测上述指标,比较二者扩增效果。结果:1.1.064g/L组的CD34+细胞数、CFU-mix产率分别比1.077g/L<WP=5>组高3.7倍和1.6倍,说明比重1.064g/L的分离液分离的脐血所含造血干/祖细胞含量高、细胞增殖能力强。1.064g/L组MNC数是1.077g/L组的0.6倍,说明1.064g/L组的分离液有较高的干/祖细胞回收率。2.在细胞因子IL-3、SCF、GM-CSF的联合作用下,扩增第二周时,1.064g/L组的MNC数、CD34+数分别扩增了58倍、26倍;1.077g/L组MNC数、CD34+数分别扩增了27倍、23倍,两组细胞均在扩增第二周时细胞增殖能力最强。在扩增第二周时,比重1.064g/L组扩增的MNC数、CD34+数、CFU-mix总数分别是比重1.077g/L组的2.2倍、4.2倍、1.7倍,均有显著差异(P<0.05)。可见1.064g/L组扩增效果明显优于1.077g/L组。3.无血清培养体系与添加血清培养体系的的扩增效果在第二周时最好,MNC数、CD34+数无血清组分别扩增了55倍、25.8倍,有血清组分别扩增了58倍、26倍,两者无明显差异(P>0.05)。说明使用无血清体系和有血清体系进行扩增的效果相似。结论:比重为1.064g/L的Ficoll—hypaque分离干/祖细胞效果优于比重1.077g/L的Ficoll—hypaque分离效果,单位体积干/祖细胞含量高,细胞增殖、扩增能力强,为脐血基础和临床研究提供了一种简单、高效的方法。脐血扩增第二周时细胞增殖能力最强、CD34+细胞总数最多,是最佳的应用时机。无血清培养脐血造血干/祖细胞具有临床应用可行性,值得推广。