慢性牙周炎是我国乃至世界性高发的口腔感染类疾病,牙槽骨的不可逆性吸收是牙周炎疗效不佳的重要瓶颈。牙周膜干细胞(periodontal ligament stem cells,PDLSCs)是一类位于牙周膜(periodontal ligament,PDL)组织的间充质干细胞(mesenchymal stem cells,MSCs),在体外有良好的成骨和成牙骨质能力。而在牙周炎症环境中,PDLSCs的成骨能力明显降低,无法成功修复炎症牙周组织中的骨缺损。目前对炎症微环境改变PDLSCs成骨能力的机制研究多数着眼于各种信号通路和分子上,但仅调控其中某些因子无法达到有效的治疗效果,因此,找到这些因子上游细胞器水平的相关调控机制将具有更强的可操作性。内质网应激(endoplasmic reticulum stress,ER stress)是细胞的保护性应激反应,通过激活未折叠蛋白反应(unfolded protein response,UPR)来维持细胞稳态。适度的内质网应激具有保护效果,而过度的内质网应激则有破坏作用。内质网应激/UPR已被证实参与了多种慢性炎症性疾病的发生和发展,亦被证明与牙周炎症有关。同时,内质网应激/UPR特别是双联RNA激活蛋白激酶样内质网激酶(double-stranded RNA-activated protein kinase(PKR)like endoplasmic reticulum kinase,PERK)通路参与了间充质干细胞的成骨分化过程。然而,内质网应激/UPR是否参与了炎症微环境中PDLSCs成骨能力改变尚无相关报道。研究目的:探讨内质网应激及UPR的PERK通路在炎症微环境抑制PDLSCs成骨能力中的作用,为牙周炎的发病机制提供理论依据,为牙周炎的治疗提供可能靶点。研究方法:1.从临床上选取符合条件的健康牙齿及牙周炎患牙,分别随机分成3组,以健康牙作为对照。一组脱钙后制作石蜡切片,进行苏木素-伊红染色确定牙周组织完整的切片部位,继而对相应连续切片免疫组织化学染色,检测PERK通路相关因子糖调节蛋白78(glucose regulated protein 78,GRP78)、PERK、活化转录因子4(activating transcription factor,ATF4)和转录因子C/EBP同源蛋白(transcription factor C/EBP homologous protein,CHOP)的定位表达情况;刮取牙根中1/3部位根面牙周膜或残留牙周膜及炎性肉芽组织,一组经组织匀浆后行实时定量聚合酶链式反应(Quantitative Real-time Polymerase Chain Reaction,q RT-PCR),一组行组织蛋白裂解后使用蛋白印迹法(Western blot),分别检测PERK通路相关因子的基因和蛋白的定量表达情况。2.从临床上选取健康的牙齿,使用酶组织块消化法,从根中1/3部位根面牙周膜组织中在体外分离培养出PDLSCs,使用有限稀释法进行细胞纯化,通过克隆形成实验证明细胞克隆形成能力,流式细胞仪检测细胞MSCs特异性表面标记物验证细胞间充质干细胞特性,成骨和成脂诱导检测细胞多向分化能力,以对细胞进行鉴定。使用内质网应激激活剂衣霉素(tunicamycin,TM)和毒胡萝卜素(thapsigargin,TG)对PDLSCs刺激,以未经激活剂刺激的PDLSCs作为对照,行q RT-PCR检测不同时间点(6 h、9 h和12 h)PERK通路相关因子在PDLSCs中的基因表达水平;同时进行成骨诱导,通过q RT-PCR和Western blot检测成骨相关因子碱性磷酸酶(alkaline phosphatase,ALP)的基因表达以及Runt-相关转录因子2(runt-related transcription factor 2,Runx2)和骨钙蛋白(osteocalcin,OCN)的基因和蛋白表达水平,通过ALP染色和茜素红染色检测细胞的ALP活性和矿化结节形成能力。3.使用梯度浓度(1 ng/ml、10 ng/ml和20 ng/ml)的炎性因子肿瘤坏死因子α(tumor necrosis factor-alpha,TNF-α)模拟炎症环境,对PDLSCs进行刺激,以未经TNF-α刺激的PDLSCs作为对照,通过q RT-PCR和Western blot检测不同时间点(6 h、12 h、24 h和72 h)PDLSCs中PERK通路相关因子的基因和蛋白表达水平;同时进行成骨诱导,通过q RT-PCR、Western blot、ALP染色和茜素红染色检测细胞的成骨能力。从而筛选出合适的TNF-α刺激浓度及作用时长。4.用梯度浓度(0.5 m M、1 m M、2.5 m M、5 m M和7.5 m M)的内质网应激抑制剂4-苯基丁酸(4-phenylbutyric acid,4-PBA)处理PDLSCs,使用CCK-8检测12 h和24 h时细胞的增殖情况以测试4-PBA的细胞毒性,确定其合适的预处理时间。使用梯度浓度的4-PBA预处理PDLSCs后,用筛选出的TNF-α浓度刺激细胞,以未经4-PBA预处理仅由TNF-α刺激的PDLSCs作为对照,通过q RT-PCR和Western blot检测PDLSCs中PERK通路相关因子的基因和蛋白表达水平;同时进行成骨诱导,通过q RT-PCR、Western blot、ALP染色和茜素红染色检测细胞的成骨能力。5.用PERK小干扰RNA(small interfering RNA,si RNA)对PDLSCs进行转染,以仅导入脂质体的空载细胞作为对照,检测PERK的基因转染效率和蛋白抑制率。转染48 h后,使用10 ng/ml的TNF-α刺激细胞12 h,以经TNF-α刺激的空载PDLSCs作为对照,通过q RT-PCR和Western blot检测不同时间点PDLSCs中PERK、ATF4和CHOP的基因和蛋白表达水平;同时进行成骨诱导,通过q RT-PCR、Western blot、ALP染色和茜素红染色检测细胞的成骨能力。研究结果:1.在牙周炎患牙的炎性牙周膜和肉芽组织中,PERK通路相关因子GRP78、PERK、ATF4和CHOP的免疫组化染色阳性率、基因表达和蛋白表达与健康牙周膜组织相比明显升高。2.从健康牙周膜组织中可成功分离培养出牙周膜干细胞,纯化后,其形态呈长梭状,呈克隆化生长,阳性表达CD146、CD105、CD90和CD44等MSCs特异性表面标记物,不表达内皮细胞标记物CD31和造血干细胞标记物CD34,具有良好的成骨和成脂分化能力。PDLSCs经1μg/ml TM刺激6 h和9 h后,PERK通路相关因子的m RNA表达较未刺激组均明显上升,12 h时各因子表达出现明显回落;经0.1μM TG刺激后,GRP78、PERK和ATF4的m RNA均仅在9 h时较未刺激组明显升高,CHOP的m RNA在9 h和12 h均明显升高。TM组与TG组9 h时相比,PERK通路各因子的表达量明显升高。成骨诱导后,经TM或TG刺激的PDLSCs的ALP基因表达及活性、Runx2和OCN的基因和蛋白表达以及矿化结节形成能力均较未刺激组明显降低,且TM组低于TG组。3.刺激PDLSCs 12 h时,三种浓度的TNF-α均使PERK通路相关因子的基因和蛋白表达明显升高并达到峰值,1 ng/ml的TNF-α对PERK、ATF4和CHOP的基因和蛋白激活能力相对较弱。在72 h时,10 ng/ml TNF-α组ATF4的表达量和PERK的蛋白水平比20 ng/ml组更高。成骨诱导后,3种浓度的TNF-α均可抑制ALP基因表达及活性、Runx2和OCN的基因和蛋白表达以及矿化结节形成能力,其中10 ng/ml和20 ng/ml的TNF-α对细胞ALP活性、Runx2的基因表达、OCN的基因和蛋白水平以及矿化结节形成的抑制能力高于1 ng/ml的TNF-α。由此确定后续实验选取浓度为10ng/ml的TNF-α来模拟炎症环境,并在刺激12 h时对PERK通路相关因子进行检测。4.浓度为7.5 m M的4-PBA对PDLSCs预处理24 h时,细胞增殖水平明显下降,体现出细胞毒性。经梯度浓度4-PBA预处理12 h后使用TNF-α刺激PDLSCs 12 h,结果显示较低浓度的4-PBA(0.5、1和2.5 m M)较未预处理对照组可有效抑制PERK通路相关因子的m RNA表达和GRP78、PERK及ATF4的蛋白水平,且三者间没有统计学差异。而7.5 m M的4-PBA仅能抑制CHOP的m RNA表达,却提高了PERK的m RNA及蛋白表达和ATF4的蛋白水平。成骨诱导后,较低浓度的4-PBA较未预处理对照组可有效提升ALP基因表达、Runx2的基因和蛋白表达、OCN的蛋白水平以及矿化结节能力,1 m M和2.5 m M的4-PBA还可使OCN的转录水平明显升高。7.5 m M的4-PBA却抑制了Runx2的基因和蛋白、OCN的蛋白表达和细胞ALP活性。5.转染PERK si RNA的PERK基因抑制效率为56%,蛋白表达抑制效率为52%。PERK未被沉默时,TNF-α可使PERK、ATF4和CHOP的基因和蛋白表达较未刺激对照组明显上升,而PERK被沉默后,即使被TNF-α刺激12 h,3种基因和蛋白表达仍然明显回落。成骨诱导后,空载的PDLSCs经TNF-α持续刺激后,成骨能力较未经TNF-α刺激对照组均明显下降,而在PERK基因沉默后由TNF-α刺激PDLSCs,其成骨能力较空载组明显回升。结论:1.在牙周炎患牙的炎症牙周膜及肉芽组织中,内质网应激和PERK通路处于激活状态;2.内质网应激激活剂可有效激活PDLSCs的内质网应激和PERK通路并抑制细胞的成骨能力;3.在慢性炎症微环境中,TNF-α可通过激活细胞的内质网应激和PERK通路来抑制PDLSCs的成骨能力,该作用可被内质网应激抑制剂4-PBA或PERK沉默而逆转。