目的:随着患病率逐年增高,糖尿病已成为一个最具有挑战性的全球性公共健康问题。糖尿病与各种微血管并发症密切相关,其中就包括糖尿病肾病和糖尿病视网膜病变等。根据美国肾脏数据系统（United States Renal Data System,USRDS）以及中国肾脏病监控网络（China Kidney Disease Network,CK-NET）年度数据报告,糖尿病肾病已超过肾小球肾炎,成为慢性肾脏病（Chronic kidney disease,CKD）的首位病因,约占总体病因的27.0%。糖尿病肾脏病变（Diabetic Kidney Disease,DKD）,也称为糖尿病肾病（diabetic nephropathy,DN）的发生发展机制十分复杂尚未得到完全明确。目前传统观点认为,糖尿病肾病的发病机制涉及遗传因素、血流动力学因素、葡萄糖和/或脂质代谢紊乱等等。随着研究的深入,巨噬细胞在糖尿病肾病发病机制中的作用逐渐受到人们的关注。在DKD中,大量单核细胞/巨噬细胞积聚在肾小球和肾小管间质区中。各种炎症细胞浸润和炎症因子释放可能在DKD的发生和发展中起到重要作用。巨噬细胞是炎症因子释放的重要来源细胞之一。巨噬细胞并可根据需要进行经典（M1）或替代（M2）激活。处于M1极化状态的巨噬细胞分泌的多种促炎性炎症因子,可引起组织炎症反应,加重组织损伤。在巨噬细胞的极化过程中常涉及多条信号通路。其中,Notch信号通路是在多种生物体上高度保守的信号通路,可以调节细胞增殖、代谢、分化和细胞存活等诸多生物学活动。而在糖尿病肾病状态下,巨噬细胞的活化是否与Notch信号通路相关,以及下游将以何种方式发挥效应目前尚不清楚。坏死性凋亡（Necroptosis）是一种最新被发现的程序性细胞死亡的方式。多项研究报道,肿瘤坏死因子（tumor necrosis factor,TNF）可介导并促进组织细胞发生坏死性凋亡。目前研究认为,坏死性凋亡是由受体相互作用蛋白激酶1（RIPK1）、受体相互作用蛋白激酶3（RIPK3）和假激酶混合谱系激酶结构域样蛋白（MLKL）等信号级联反应驱动的。随后,伴随着细胞和细胞器的肿胀,细胞破裂并释放细胞内容物,进而导致细胞的死亡。目前有研究亦证实糖尿病肾病中肾脏固有细胞存在坏死性凋亡现象,但相关机制尚不明确,有待于进一步探究。间充质干细胞（mesenchymal stem cell,MSC）是一类具有多向分化潜能的细胞。间充质干细胞起源于中胚层,主要存在于骨髓中,也存在于脂肪、肌肉、皮肤、脐带、胎盘等多种组织中。间充质干细胞虽然具有良好的肾脏修复能力,但由于其存在潜在细胞污染风险,且培养需要一定的时间,同时常涉及安全以及伦理等问题。目前,临床使用上可能存在诸多限制。最新研究表明间充质干细胞可以衍生出多种外囊泡（mesenchymal stem cell-derived extracellular vesicles,EVs）,根据大小及来源主要分为外泌体（exosomes,Exo）、微泡（micro vesicles,MV）及凋亡小体（apoptotic bodies）3种。研究证实,外泌体可作为一种新的细胞间信号转导的载体,通过与靶细胞的特殊反应及传递基因物质如m RNA、mi RNA等,参与组织的修复过程。目前研究已发现,Exo可以减轻代谢综合征合并肾动脉狭窄的模型猪的肾脏炎症,并同时可改善其肾髓质氧化应激和纤维化的水平。因此,Exo作为一种新的非细胞性替代物,具有获取相对便捷,无伦理学问题等优点,在治疗糖尿病肾病方面具有非常好的应用前景。本研究通过在体内及体外实验研究巨噬细胞在糖尿病肾病发生发展中的作用,以及高糖刺激下巨噬细胞极化相关信号通路变化,以及过度M1极化的巨噬细胞对肾脏固有细胞损伤的影响。初步探究了间充质干细胞衍生的外泌体对高糖刺激巨噬细胞的影响。本研究将为糖尿病状态下巨噬细胞介导的肾脏炎症的发生、发展机制以及间充质干细胞外泌体的治疗靶点提供研究依据。研究方法:1.对肾活检患者肾脏病理切片进行病理学分析,免疫组化染色,和TUNEL检测。2.利用免疫荧光双染CD68/i NOS,CD68/Arg-1检测患者肾脏中巨噬细胞极化情况。3.建立氯磷酸盐脂质体慢性清除巨噬细胞的db/db小鼠模型,以研究巨噬细胞在糖尿病肾病发病机制中的作用。4.体外构建si Notch1,NICD over expression的RAW264细胞,以研究Notch通路在巨噬细胞极化中的作用。5.应用免疫共沉淀,激光共聚焦显微镜进行核-质定位分析,检测Notch与NF-κB通路关键蛋白之间的信号串扰。6.提取小鼠腹股沟脂肪间充质干细胞,为后续间充质干细胞外泌体研究做前期准备。7.通过间充质干细胞外泌体与巨噬细胞共培养,探究干细胞外泌体在调节巨噬细胞表型转换与极化中的作用。8.使用western blot分析Notch1、NF-κB p65、Collagen IV、Fibronectin、TNF-αR、RIP-1、RIP-3、MLKL、i NOS、Arg-1、IL-1β、TNF-α和TGF-β等蛋白水平的表达变化。9.RT-q PCR检测mi R-22、mi R-182、mi R-125a、i NOS、Arg-1、MCP-1、CCL-8、CXCR-4和CXCL-12等RNA表达变化。10.统计学分析,每组实验至少重复3次以上,计量资料数据使用平均值±标准差表示,t检验,方差分析,以及Fisher最小显著差检验均在spss 22.0上进行,p＜0.05认为存在统计学意义。结果:1.经肾活检确认的糖尿病肾病患者的肾组织切片中,可以观察到大量浸润的单核细胞/巨噬细胞。系膜细胞过度增殖和系膜基质弥漫性增生。Masson染色显示肾小管间质区存在显著的纤维化。此外,在病理染色中,我们还发现肾小管细胞存在颗粒变性和空泡变性,部分肾小管上皮细胞的刷状缘脱落,肾小管细胞萎缩和死亡。此后,通过双重免疫荧光染色评估了糖尿病肾病患者肾活检组织的石蜡切片。在患者肾小管间质区发现了大量浸润的巨噬细胞,通过免疫荧光双重染色证实其以M1表型为主（CD68+/i NOS+）。2.我们构建了氯膦酸钠脂质体（CL）慢性清除巨噬细胞的db/db小鼠模型。我们发现在清除巨噬细胞后,小鼠的血糖、肾功能和蛋白尿水平得到显著改善。通过病理分析结果显示巨噬细胞清除疗法显著改善了小鼠肾脏病理变化,治疗后小鼠系膜细胞增殖和系膜基质分泌减少,纤维化程度较治疗前亦有所下降。透射电子显微镜（transmission electron microscope,TEM）显示治疗组的基底膜增厚以及足突融合消失等病理变化得以改善。3.通过对小鼠肾组织切片进行TUNEL染色,我们发现TUNEL阳性细胞的数量显著增加。随后,我们对小鼠肾石蜡切片进行免疫组织化学,及Western Blot分析,我们发现糖尿病肾病组肾小管区的TNF-α表达水平显著增加,坏死性凋亡通路相关蛋白TNF-αR、RIP-1、RIP-3和MLKL在糖尿病肾脏组织中表达显著增加。清除巨噬细胞后,肾组织中的TNF-α和坏死性凋亡通路相关分子TNF-αR/RIP1/RIP3/MLKL的水平显著降低。此外,小鼠肾组织中炎症因子IL-1β和IL-18以及细胞外基质蛋白:胶原IV（Col IV）和纤连蛋白（FN）的表达水平显著升高,CL治疗后其水平显著降低。这些结果表明巨噬细胞清除疗法显著减轻了组织炎症并可改善肾脏的纤维化损伤。4.随后,我们在体外培养小鼠巨噬细胞系RAW264.7。在高糖刺激下,巨噬细胞趋向M1极化,表现为i NOS、TNF-α和IL-1β表达增加。同时,与在正常糖环境中培养的巨噬细胞相比,巨噬细胞中Notch1的表达水平显著增加。使用si RNA抑制Notch1的活性后,NF-κB通路相关分子IKK-B和p65及下游炎症因子IL-1β和TNF-α的表达明显下调。巨噬细胞在过表达NICD后即使在正常糖培养下,巨噬细胞也趋向于M1样的表型,表现为i NOS及炎症因子表达水平显著增加。同时,p65和IKK-B的表达水平也同样增加。通过NF-κB荧光素酶报告基因检测,我们发现在高糖培养的条件下,敲低Notch1后NF-κB的活性会显著降低,而在NICD过表达后,即使在正常糖培养的条件下NF-κB的通路活性也会增强。同时,我们还通过相互免疫共沉淀（co-IP）检测了Notch与NF-κB p65之间的相互作用。结果显示抗Notch1的单克隆抗体共沉淀了p65,而抗NF-κB p65单克隆抗体也共沉淀了Notch1。此外,在Notch1敲减后,Notch1和NF-κB p65之间的相互作用有所减少,而NICD过表达增加了Notch1和NF-κB p65之间的相互作用。5.我们对Notch1和NF-κB p65进行了双重免疫荧光染色,并使用激光扫描共聚焦显微镜对其进行细胞质和细胞核的定位分析。结果发现Notch1的表达在高糖条件下显著增加,并伴随着进入细胞核的NF-κB p65的显著增加。在Notch1被敲低后,细胞核中p65的荧光强度也显著降低。此外,在正常糖培养的细胞中过表达NICD后,细胞核中p65水平也随之增加。上述研究结果表明,Notch1过表达可激活NF-κB通路的关键分子NF-κB p65,进而介导其下游炎症通路分子的表达。6.通过细胞共培养我们发现,在高糖状态下,巨噬细胞和系膜/肾小管细胞的共培养组的细胞培养上清液中MCP-1的水平显著增加（与单培养组相比）。接下来,我们从共培养的系膜细胞中提取蛋白质并通过免疫印迹分析蛋白表达。在高糖条件下共培养的系膜细胞中炎症因子IL-1β和IL-18的水平显著增加。此外,细胞外基质蛋白FN和Col IV的表达水平在系膜细胞中也显著增加。而后我们使用si RNA敲低巨噬细胞中的Notch1后,在高糖条件下共培养的系膜细胞中炎症因子IL-1β和IL-18以及细胞外基质蛋白FN和Col IV的水平发生下降。7.我们在高糖条件下共培养巨噬细胞和肾小管基质细胞。通过免疫印迹分析,我们发现巨噬细胞在高糖刺激下可以分泌产生大量TNF-α。在高糖条件下,与肾小管细胞共培养后的巨噬细胞中TNF-α水平显著高于在高糖下单独培养的巨噬细胞。此外,在巨噬细胞中敲低Notch1后,TNF-α的水平下降。随后我们使用免疫印迹（WB）检测经典坏死性凋亡途径通路蛋白RIP1/RIP3/MLKL/p-MLKL的表达水平。与正常糖组相比,高糖组的坏死性凋亡途径标志物蛋白RIP1、RIP3、MLKL和pMLKL的水平显著增加。与高糖中的巨噬细胞共培养后,肾小管细胞中RIP-1、RIP-3和MLKL的水平进一步增加。当细胞与高糖中的Notch1敲低巨噬细胞共培养时,RIP-1、RIP-3和MLKL的表达水平有所下降。通过我们使用PI/Annexin V细胞染色并用流式细胞术来分析细胞死亡情况,也得到了同样的结果。8.随后我们分离并培养了小鼠腹股沟脂肪间充质干细胞,在光学显微镜下观察其呈长梭形、旋涡状。成脂诱导、成骨诱导显示,分离的间充质干细胞具有成骨、成脂分化的能力。通过流式细胞术鉴定细胞表面的标志物,结果显示干细胞标志物CD90,CD44呈阳性,造血细胞标记物CD31和CD117阴性,符合对MSC的表型特征以及成骨、成脂分化能力的要求。9.我们使用超速离心的方法从MSC细胞培养上清液中分离出外泌体。我们使用蛋白免疫印迹分析对分离的外泌体进行表型验证,结果显示外泌体特异性标志物CD9和TSG 101在外泌体中高表达、细胞中表达水平很低,内质网标记物Calnexin,存在于MSC细胞中但不存在于外泌体中。证明超速离心法分离出的物质为外泌体。10.将MSC-Exo添加到体外培养的高糖刺激的RAW264.7细胞中。48小时后,我们使用RT-q PCR检测了巨噬细胞表性标志物i NOS和Arg-1的表达水平。结果显示,我们发现MSC-Exo抑制了M1型细胞标志物i NOS的表达上调,并升高了M2标志物Arg-1的表达。这些数据表明MSC-Exo可以调节高糖刺激下巨噬细胞并诱导其向M2极化。我们经RT-q PCR进一步证实,MSC-Exos中含有mi R-22并且mi R-22参与了MSC-Exo介导的的巨噬细胞表型调节,而抑制mi R-22则减弱了这一作用。结论:1.巨噬细胞在糖尿病肾病发病机制中起到关键作用,清除巨噬细胞可有效改善糖尿病肾病病理损伤,肾脏炎症,及肾小管细胞的坏死性凋亡。2.糖尿病肾病状态下,巨噬细胞中Notch1通路活化将影响NF-κB信号转导,进而介导下游炎症因子通路的激活,增加炎症因子释放。3.间充质干细胞衍生的外泌体可以改善高糖刺激下巨噬细胞的极化状态,发挥免疫调节的作用。