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异嗜性鼠白血病病毒相关病毒核酸及抗体检测方法的建立及应用研究
本文针对目前异嗜性鼠白血病病毒相关病毒(Xenotropic murine leukaemia virus-related virus，XMRV)研究的热点——临床样本中是否存在XMRV（包括核酸和抗体）的实验室检测方法的建立进行了探讨，共由两部分研究组成。
XMRV最先于2006年在RNase L基因缺陷型的前列腺癌组织中发现，其序列约8.200 bp，与鼠白血病病毒(Murine leukemia virus. MLV)的同源性达到近95％。2009年美国惠特莫尔·彼得森(Whittemore Peterson Institute, WPI)神经免疫疾炳研究所的Lombarai等的研宄表明，XMRV与慢性疲劳综合症(Chronic fatiguesyndrome，CFS)患者密切相关，但其后世界各地的众多研究者均未能重现该结果。XMRV与人类疾病之间是否具有相关性尚不清楚，因此建立具有高灵敏和特异性的XMRV核酸和抗体的检测方法势在必行，从而为XMRV是否致病的研究提供可靠的实验室检测技术。
在第一部分中，我们首先建立了避免XMRV核酸漏检的多重荧光定量聚合酶链反应(Ploymerase chain reaction. PCR)/逆转录(Reverse transcription. RT)-PCR测定方法，并对CFS患者进行检测，探讨XMRV与CFS疾病是否具有相关性。本研究采用重叠PCR(Overlap PCR)技术构建重组质粒pACYC-MS2-2V和pACYC-MS2-IC-2V作为XMRV DNA质控品和内标。利用MS2噬菌体蛋白质和基因组RNA相互作用的机制及噬菌体衣壳蛋白空间构象的特点进行噬菌体颗粒的包装，将pACYC-MS2-2V和pACYC-MS2-IC-2V分别转化大肠杆菌菌株BL21(DE3)，超声碎菌后，离心收集上清，上清中分别含己表达出的XMRV RNA的病毒样颗粒(Virus-like particles. VLPs)标准品(VLPs-standard)和内标VLPs(VLPs internalcontrol, VLPs-IC)。在上清中加入DNase I和RNase A,37℃过夜消化，以去除其中的DNA和RNA，并用分子筛色谱层析纯化VLPs。我们在pACYC-MS2-2V和pACYC-MS2-IC-2V嵌合体序列中加入HCV5-UTR序列，可以用HCV RNA的国际标准品定标VLPs内的嵌合体RNA，从而解决了其无国际标准品RNA病毒的量值溯源问题，并实现对VLPs的定量。以定量的XMRV DNA/VLPs作为质控品或标准品及内标建立多重荧光定量PCR/RT-PCR检测体系，并应用该检测体系对CFS患者外周血单个核细胞(Peripheral blood mononuclear cell，PBMC)及血清进行检测。结果显示我们建立的多重荧光定量PCR/RT-PCR柃测体系的灵敏度可达到20copies/反应/10 IU/mL，其特异性均可以达到100％，批内和批间的变异系数分别为1.76%-2.80％/1.70%-2.59%和1.07%-2.56%/1.06%-2.74％CFS患者PBMC及血清中均未检测到XMRV，说明XMRV与CFS之间无相关性。以上结果表明，我们成功建立了避免XMRV核酸漏检的多重荧光定量PCR/RT-PCR测定方法，其优点包括可最大限度的避免XMRV的漏检；所制备的内标稳定、对人安全、耐DNase和RNase，可有效防止假阴性结果的出现，使实验结果更加可靠：应用该检测方法对CFS患者进行检测得到的阴性结果，进一步丰富了XMRV在CFS中的研究内容，具有一定的临床价值和科学意义。
在第二部分中，建立双抗原夹心酶联免疫吸附试验(Fnzvme-linkedimmunosorbent assav，ELISA)方法应用于血清抗XMRV-包膜蛋白(Env)-gp70，跨膜蛋白(TM)-p15E及gag衣壳蛋白(CA)-p30蛋白抗体的检测,并用该方法测定免疫功能障碍患者血清中上述抗体的分布情况，了解它们与疾病是否具有相关性。本研究采用PCR方法分别扩增XMRV-p70、 p15E、p30编码的核苷酸序列，并将其分别克隆入原核表达载体pET16b及pET16b-Eseb，获得原核重组表达载体pET16b-gp70/p15E、pET16b-Eseb-p30，在大肠杆菌原核表达系统中表达，通过包涵体分离和Ni2+亲和层析纯化得到了gp70、p15E、p30目的蛋白。选取新西兰大白兔(2kg)分别制备兔抗gp70、p15E、p30蛋白多克隆抗体，并纯化和验证。最后建立双抗原夹心ELISA方法检测系统性红斑狼疮(Systemic lupus erythematosus，SLE.)、类风湿性关节炎(Rheumatoid arthritis，RA)、系统性硬化症(Progressivesystemic sclerosis.pSS)和结核(Tuberculosis.TB)以及正常人血清中抗gp70、p15E、p30抗体的分布情况，同时采用免疫印迹方法(Western blot，WB)进行验证。结果显示RA、SLE、pSS和TB以及正常人血清中均不存在抗gp70、p15E、p30抗体，表明上述疾病与XMRV不存在相关性。我们的研究首次应用较大样本量的RA、SLE、pSS和TB血清抗gp70、p15E、p30抗体的检测，阴性结果可判断XMRV与RA、SLE、pSS和TB之间没有相关性。