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糖尿病是全球最普遍的全身性代谢病之一,传统的药物疗法和胰岛素注射疗法不能从根本上治疗糖尿病。胰岛移植能够有效的控制血糖变化,避免并发症的发生,然而由于供体不足和免疫排斥,使其应用受到限制。在细胞水平上通过定向诱导的方法,将多潜能性干细胞向具有胰岛素分泌功能的细胞进行诱导分化,为糖尿病治疗研究提供新方法。脂肪间充质干细胞(Adipose-derived mesenchymal stem cells,ADSCs)易于分离培养,且较少涉及到医学伦理问题,并且具有抑制受体淋巴细胞增殖和保护胰岛β细胞免受自体免疫破坏的独特优势,是治疗糖尿病的理想种子细胞。Pdx1、Ngn3、Pax4和Nkx2.2作为级联调控关键基因,在胰腺、胰岛细胞发育和成熟过程中起重要调控作用。将这些基因分别单独转入ADSCs,可诱导其向胰岛素分泌细胞(Insulin producing cells,IPCs)分化,但所分泌的胰岛素含量不随糖浓度而变化,不具有功能性胰岛β细胞的性质,通过其他基因配合组成多基因组合联合转染,为重编程ADSCs的转分化研究提供了新思路。因此,本试验在这些级联调控关键基因的基础上引入经过功能验证的Sox9基因,探究这五种基因组成的不同多基因重组腺病毒感染犬ADSCs后,对犬ADSCs向IPCs分化的影响。主要研究结果如下:1、成功构建了Sox9、Fev、Gata4单基因真核过表达载体和腺病毒过表达载体,用它们分别感染犬ADSCs,通过对感染后细胞的形态学观察结果和胰岛发育相关基因m RNA表达水平进行对比筛选,发现真核过表达载体转染效率过低,不能满足试验要求;而腺病毒过表达载体具有较好的转染效率,是基因治疗中较理想的转染工具,且Sox9基因过表达腺病毒的诱导效果最佳。2、成功构建五组多基因共表达腺病毒载体,分别为A组合:p Ad Track-Pdx1-Ngn3-Ad Easy;B组合:p Ad Track-Pdx1-Ngn3-Sox9-Ad Easy;C组合:p Ad Track-Pdx1-Ngn3-Pax4-Sox9-Ad Easy;D组合:p Ad Track-Pdx1-Ngn3-Nkx2.2-Sox9-Ad Easy;E组合:p Ad Track-Pdx1-Ngn3-Nkx2.2-Pax4-Ad Easy,并将它们成功包装为具有感染性的腺病毒。感染犬ADSCs后第4天,通过RT-q PCR和Western blot检测发现各组合不同外源目的基因均实现过表达。3、通过对感染犬ADSCs后第30天的细胞进行形态学观察、双硫腙染色、糖刺激胰岛素分泌试验、细胞免疫荧光及RT-q PCR等检测,对比筛选得到最佳诱导组合E组合(p Ad Track-Pdx1-Ngn3-Nkx2.2-Pax4-Ad Easy)。该组合重组腺病毒感染细胞在高糖(25 mmol/L)刺激下,胰岛素分泌量和细胞内胰岛素含量分别可达到100.94±3.70和109.08±4.88μIU/10~5 cells。综上所述,本研究成功构建了携带有Pdx1、Ngn3、Sox9、Pax4和Nkx2.2基因的五组不同的多基因共表达腺病毒载体,包装为腺病毒毒液感染犬ADSCs后进行诱导分化效果检测,结果发现Pdx1、Ngn3、Nkx2.2和Pax4基因联合转染组诱导效果最佳,为进一步探究犬ADSCs向IPCs诱导分化的更高效方案奠定了基础。