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高危型人乳头瘤病毒(Humanpapillomavirus,HPV)持续性感染被认为是引起黏膜组织上皮细胞病变,继而导致女性宫颈癌、阴道癌和男性阴茎癌等癌症疾病发生的最主要原因。其中,宫颈癌是目前最常见的妇科恶性肿瘤之一,全球每年有超过50万女性被诊断出患有宫颈癌。在中国,每年也约有10万例宫颈癌新增病例。HPV是一种无包膜的双链DNA病毒,其病毒衣壳由主要衣壳蛋白(L1)和次要衣壳蛋白(L2)组成。在体外,72个L1五聚体可以自组装形成T=7的病毒样颗粒(Virus-like particles,VLPs)。研究表明,HPVL1-VLPs诱导机体产生的中和抗体能够对HPV病毒感染过程中的不同环节进行干预从而有效抵御HPV病毒的感染。但是,由于目前还缺乏高分辨率的HPV中和抗体免疫复合物结构信息,难以有针对性地对抗体中和表位展开相关功能研究,从而限制了我们从分子水平上去理解病毒的感染机制以及HPV抗体抵抗病毒感染的中和模式。HPV主要衣壳蛋白L1的表位高度使得由L1形成的VLP疫苗免疫产生的抗体具有高度型特异性,难以提供型交叉保护。而HPV的流行病学研究结果表明,能够引发恶性肿瘤发生的HPV型别多达15种。目前最新上市的HPV九价疫苗也只能提供针对7个高危型别HPV感染的保护,且该疫苗采用的是野生型HPV病毒样颗粒(VLP),剂量已达270μg,难以进一步增加HPV型别以扩大保护范围。因此,有必要深入展开HPV型特异性特征的结构研究,找到能够打破HPV严格型特异性的关键所在,从而为新型广谱HPV疫苗的分子设计提供新的思路。针对以上科学问题,本研究从不同型别HPV单抗盘中筛选出具有代表性的型特异性中和抗体,利用结构生物学手段解析高分辨率HPV免疫复合物的空间结构,精确定位多个型特异性中和表位的位置所在,从分子水平上阐释型特异性中和抗体的中和模式。并且基于该表位信息展开病毒学功能研究,为揭示HPV基础病毒学过程以及HPV型特异性奠定理论基础。首先,我们从HPV58和HPV59型单抗盘中选择了两株具有高中和效价的型特异性抗体HPV58.A12A3和HPV59.28F10。通过分别对抗体与VLP以及五聚体抗原的ELISA反应活性进行比较,发现了抗体A12A3对于五聚体与VLPs之间存在的微弱构象差异较为敏感;而抗体28F10的抗原表位在VLPs和五聚体上未产生明显变化。另外,对抗体不同的功能分子(IgG和Fab)中和能力的检测结果发现,两个抗体的IgG中和效价均显著高于其Fab分子。通过对两种颗粒免疫复合物分子VLP:IgG和VLP:Fab进行电镜观察,发现两个抗体的IgG分子具有交联抗原颗粒的能力,解释了两个抗体IgG分子中和能力强于Fab分子的现象。其次,利用X-射线晶体学技术成功解析了 HPV58 pentamer、HPV58 pentamer:A12A3 Fab 和 HPV59 pentamer:28F10 Fab 三个样品高分辨率晶体结构,分辨率分别为:2.0A,3.5A和3.4A。结构表明抗体A12A3和28F10是两种在结合HPV模式上具有显著差异的HPV中和抗体:A12A3以一个Fab结合在抗原五聚体中央孔洞上,而28F10则为5个Fab片段结合在抗原五聚体的每个L1单体上。进一步的表位分析结果表明,两个抗体识别的抗原表位均只有6～7个氨基酸,其中A12A3抗体识别的是抗原五聚体上相邻两个L1单体上的DE loop(Q165a,D154b,R161b,Q165b,S168b和N170b),而 28F10 与抗原的结合则完全通过 L1 单体上 FG loop 介导(M267,G268,Q270,E273,Y276,K278,D281和R283)。接着利用低温电镜技术解析了两个抗体的VLPs颗粒复合物结构,分辨率分别为9.5 A和8.4 A(FSC=0.143),证实了两个抗体结合五聚体的方式与其结合病毒颗粒中作用方式一致。然后,基于两个复合物晶体结构中抗原抗体相互作用界面上的抗原位点,制备了多个五聚体形式和VLPs颗粒形式的定点突变体。通过ELISA结合实验以及SPR技术对两个型别各突变抗原与A12A3和28F10的反应活性分别进行了考察,结果表明HPV58L1位点R161对于抗体A12A3识别HPV58抗原具有关键作用;而HPV59L1位点E273和R283则对于HPV59抗原与抗体28F10的结合扮演重要角色。最后,我们构建HPV58和HPV59多个定点突变型假病毒,以考察了两个型特异性中和表位是否参与了病毒感染的过程。病毒感染实验结果充分说明,HPV58L1蛋白序列位点D154,S168和N170对于HPV58病毒感染细胞过程具有关键的作用;而HPV59L1蛋白的FG loop上的6个位点(E273A,Y276A,R283A,M267,Q270和K278)均能显著影响HPV59病毒感染宿主细胞的能力。进一步地,我们借助在进化关系上距离HPV58和HPV59最近的型别——HPV33和HPV18,将抗体识别的差异位点分别对应地同源置换至HPV33和HPV18L1的对应位点上(H33-K161R,H33-A168S,H33-T168N 和 H33-KAT,以及H18-T270Q,H18-Q273E,H18-G281D 和 H18-TQG),然后在 VLPs 和假病毒水平上分别验证异型突变体与对应抗体的反应活性。结果发现,三点共突变后均能够较大程度地提高与A12A3或者28F10的抗体结合活性。因此,我们认为,这几个位点对于其型特异性确立起到了十分关键的作用。综上所述,本研究利用结构生物学技术、生物化学、分子及细胞生物学手段,从空间结构上对HPV型特异性中和表位进行了研究,阐释了 HPV型特异性抗体中和病毒感染的分子机制。同时,基于对表位信息的功能研究,证实了两株抗体的中和表位参与了病毒的感染过程以及进化过程中型特异性的产生,从而为实现型交叉保护的HPV疫苗分子设计以及以抗病毒中和位点为靶标的治疗药物研发奠定了理论基础。