疟疾是由疟原虫感染人体引起的一种虫媒寄生虫病。目前全球每年约有2亿多人感染,造成60多万人死亡,其中大部分发生在非洲。2006年,世界卫生组织推荐以青蒿素为基础的联合疗法（ACTs）治疗恶性疟原虫感染,疟疾的感染率和死亡率均大幅下降。但随着青蒿素类抗疟药物在全球的广泛使用,全球多个地区已经发现青蒿素耐受的恶性疟原虫株。2014年,有研究发现恶性疟原虫k13（Plasmodium falciparum Kelch 13,Pfk13）基因Kelch结构域突变与青蒿素的耐受性有关,但k13不同位点的突变与青蒿素耐受的关联性有待进一步确认,而且不同遗传背景的虫株即使具有同样k13突变,其耐受水平也有明显差异。本课题组前期研究报道了首例非洲来源的恶性疟原虫青蒿素耐药虫株,并发现其k13基因带有M579I突变。随后,国际同行对实验室虫株（3D7）的k13进行M579I位点突变,也发现其对青蒿素的敏感性显著下降。但非洲恶性疟原虫株M579I突变是否与青蒿素耐受性的相关性并不确定,而且这些k13位点突变引起青蒿素耐受的分子机制也未明确。因此,本课题对恶性疟原虫非洲地理株的k13基因M579I突变与青蒿素耐受的相关性进行了研究,并对M579I突变引起的青蒿素耐受的机制进行初步探讨。第一部分恶性疟原虫非洲地理株k13基因M579I突变与青蒿素耐受的相关性研究目的:为了验证恶性疟原虫非洲地理株k13基因M579I位点突变能否导致青蒿素耐受现象。方法:首先,采用环状体生存试验（RSA）对恶性疟原虫非洲地理株的青蒿素耐受水平进行体外测定,然后采用CRISPR/Cas9技术对青蒿素敏感的非洲恶性疟地理株进行k13基因的M579I突变,以及对带有M579I突变的青蒿素耐药株进行I579M回复突变,再用RSA进行青蒿素耐受性分析,从而验证非洲地理株中k13基因M579I突变与青蒿素耐受的关联性。结果:恶性疟原虫非洲地理株大部分对青蒿素较为敏感（EG-01、EG-02和EG-03的RSA结果分别为:1.02±1.00%、0.32±0.45%和0.33±0.04%）。实验室前期发现的青蒿素耐药株（CWX）及其单克隆均对青蒿素敏感性较低（CWX、CWX-9A、CWX-11F和CWX-12F的RSA结果分别为:9.00±2.31%、8.21±0.98%、9.51±2.42%和12.36±1.29%）,单克隆间耐药水平无显著性差异（P＞0.05）。对k13基因未发生突变的青蒿素敏感地理株（EG-01）进行基因编辑,成功获得M579I突变株(EG-01M579I),RSA结果显示其青蒿素耐受水平（20.34±3.56%）显著高于无突变虫株（P＜0.05）;将EG-01M579I进行克隆化,获得3株单克隆虫株(EG-01 M579I-D4、EG-01 M579I-D10和EG-01 M579I-E5),RSA显示单克隆间耐受水平（分别为:11.69±4.20%、8.48±3.08%和9.96±0.82%）差异无统计学意义（P＞0.05）,均高于EG-01（P＜0.05）。突变后虫株生长速率明显高于突变前,且差异有统计学意义（P＜0.05）。构建k13-I579M的回复突变质粒,进行电转染,对其回复突变,但未获得突变株。结论:本部分研究证实非洲输入地理株k13基因的M579I突变与青蒿素耐受性相关。第二部分恶性疟原虫非洲地理株k13基因M579I突变引起青蒿素耐受的机制初步研究目的:进一步了解非洲地理株中k13基因M579I位点突变所引起的青蒿素耐受的分子机制。方法:收集k13基因M579I突变前后的恶性疟原虫非洲地理株早期环状体,进行转录组测序（RNA-Seq）,对筛选得到转录差异基因进行功能分析,从转录水平分析非洲地理株k13基因M579I突变引起青蒿素耐受的分子机制。结果:对k13基因M579I突变前后虫株(EG-01与EG-01M579I)进行RNA-seq转录组测序,共测得5712个转录基因。具有统计学意义的差异基因共239个,上调基因为159个,下调基因为114个。GO聚类分析表明其中抗原变异家族基因普遍上调。上调基因中还有共同调控输出蛋白功能的基因,如:控制蛋白质折叠PF3D7＿1215300（10 k Da伴侣蛋白）与PF3D7＿1015600（热休克蛋白HSP60）;蛋白质输出相关的PF3D7＿0631300、PF3D7＿1101800等;PK蛋白激酶家族PF3D7＿1337100、PF3D7＿0213400;丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶FIKK1家族PF3D7＿0102600等。结论:本部分通过转录组分析显示恶性疟原虫非洲地理株k13基因M579I突变引起青蒿素敏感性下降的机制可能是通过输出蛋白功能上调,导致内吞血红蛋白作用降低有关。pfmdr1和pfmrp1等已知抗性相关基因可能与青蒿素耐受性相关。