苹果茎痘病毒(Apple stem piHing virus,ASPV)是苹果和梨树上普遍发生的一种潜隐性病毒,广泛分布于世界各苹果和梨种植区。在砧木感病时该病毒可引起树体的严重衰退,对果树生长、产量和果品质量等造成严重的影响。栽培无病毒种苗是解决苹果和梨上ASPV危害的有效途径,病毒检测是培育和繁殖无病毒苗木的重要环节。本研究采用生物学、分子生物学等方法对来源于砂梨(Pyrus pyrifolia)的P-HH和P-3-2-67及来源于葡萄的G-L3共3个样品进行了ASPV检测和鉴定。通过采用汁液摩擦接种的方法从葡萄上分离获得分离株G-L3,经生物学表现分析、病毒粒子形态电镜观察以及序列比较分析,确定来源于葡萄的分离物为ASPV。构建了来源于砂梨的ASPV的外壳蛋白(Coat protein,CP)基因原核表达载体,并成功诱导表达,制备了表达蛋白的特异性抗体。具体研究结果如下:1.通过汁液摩擦接种草本指示植物西方烟(Nicotiana occidentalis‘37B’)后,症状观察,两个来源于砂梨的分离物(P-HH、P-3-2-67)和一个来源于葡萄的分离物(G-L3)均显症明显:P-HH在接种叶片上表现凹陷坏死白斑,叶脉坏死,皱缩症状;P-3-2-67出现黑色斑点、叶脉坏死和支脉黄化;G-L3出现叶片褪绿斑点、黑色斑点和坏死症状。通过试管捕捉反转录PCR(Tube capture-reverse transcription PCR,TC-RT-PCR)对3个分离物进行扩增后,PCR产物经6%PAGE电泳后,3个分离物均在316bp处出现特异性条带。进一步提纯病毒和电镜观察,结果显示3个分离物的病毒粒子形态一致,均为弯曲的长线形病毒。由此,推测上述3个来源于砂梨和葡萄的分离物(P-HH、P-3-2-67和G-L3)均为ASPV。2.以P-HH、P-3-2-67和G-L3接种表现症状的西方烟为材料,通过TC-RT-PCR,对这3个分离物CP基因的部分序列(316 bp)进行了扩增、克隆与序列测定。经序列分析,3个分离物的扩增片段与本实验室前期从砂梨(Pyrus pyrifolia)获得的分离株P1同源性最高达98.4%,与国外报道的来自于杂种榲椁(Pyronia veitchii)上的分离株Quince同源性达93%,与来自于楹椁(Cydonia oblonga)的分离物N1最低为77.8%。3个分离物间的核苷酸序列也有一定差异,P-HH/P-3-2-67为99.1%、P-HH/G-L3为99.1%、G-L3/P-3-2-67为99.4%。由此,我们进一步判断来自于葡萄的分离物G-L3为ASPV,这是ASPV侵染葡萄首次发现。3.采用本实验室前期克隆获得的来源于梨树的ASPV分离物6-1-13的CP基因,根据其序列特征设计引物,并在两端加酶切位点,对该基因进行扩增、序列验证后,与载体pET-28a(+)连接构建了该基因的原核表达载体(pET-ASPV-CP),在大肠杆菌(Escherichia coli)BL21(DE3)中经IPTG诱导表达、表达产物经SDS-PAGE电泳和Western-blot分析,表明该CP基因在大肠杆菌中BL21(DE3)得到正确表达,融合蛋白大小约45 kDa,并且具有免疫原性。通过回收表达蛋白并免疫大耳白兔,制备了ASPV重组CP的多克隆抗体,间接ELISA测定其效价为1:1 000,Western-blot分析证明该抗体可与重组CP发生免疫反应。