论文部分内容阅读
背景和目的:食管癌的发生是机体内因和外因多因素综合作用的结果。环境危险因素相关研究显示,亚硝胺类化合物暴露和人类乳头瘤病毒(HPV)感染与食管癌发生密切相关。在食管癌的多种致癌机制研究中,微小RNA(microRNA,miRNA)作为一种表观遗传调控方式近年来成为研究热点。本课题组在淮安食管癌高发区的前期研究结果显示,食管癌患者癌组织和癌旁组织中存在一组表达紊乱的miRNA,其中miR-218表达显著下调。本研究应用课题组构建的HPV联合MNNG致食管细胞恶性转化模型,观察miR-218对恶转细胞生物学行为的影响,并对恶转细胞进行转录组学分析,探索miR-218的靶基因及其参与的信号转导通路,初步分析miR-218在HPV联合MNNG致食管癌发生过程中可能发挥的作用。方法与结果:一、miR-218对食管癌细胞及食管恶转细胞生物学行为的影响采用RT-qPCR法检测食管癌细胞(EC109/EC9706/KYSE510)、永生化食管上皮细胞(Het-1A)以及恶转过程中四组细胞不同代数miR-218表达水平;以EC109和恶转细胞为靶细胞,分别转染miR-218 mimic,并进行相应的生物学行为检测;CCK-8法和细胞平板克隆形成实验检测细胞增殖能力;Transwell迁移和侵袭实验检测细胞的迁移、侵袭能力;流式细胞术检测细胞的周期和凋亡情况。本研究中应用课题组已构建的HPV联合MNNG致食管细胞恶性转化模型(恶转细胞),细胞培养至35代,经裸鼠成瘤实验证实已发生恶性转化。根据处理方式的不同分为以下四组:HPV18转染组(HPV组)、空载体质粒转染组(对照组)、HPV与MNNG联合作用组(HPV+MNNG组)、MNNG染毒组(MNNG组)。1.miR-218对食管癌细胞EC109生物学行为的影响1.1 miR-218在三种食管癌细胞(EC109/EC9706/KYSE510)中的表达均低于永生化食管上皮细胞(Het-1A)(P<0.05)。1.2 CCK-8结果显示,转染miR-218 mimic(miR-218组)的EC109细胞增殖活性低于阴性对照组(miR-NC组)(P<0.05)。细胞平板克隆形成实验结果显示,miR-NC组和miR-218组细胞克隆率分别为(20.57±0.59)%、(9.57±0.95)%(P<0.05)。1.3 Transwell迁移实验结果显示,miR-NC组和miR-218组穿透微孔膜的细胞数分别为156.67±7.64、77.67±6.81(P<0.05);Transwell侵袭实验结果显示,miR-NC组和miR-218组穿过的细胞数分别为268.33±7.64、79.00±7.94(P<0.05)。1.4 AnnexinV-PI双染检测结果显示,miR-218组的凋亡率(12.06±0.46)%高于miR-NC组(10.40±0.97)%(P<0.05)。2.miR-218对食管恶转细胞生物学行为的影响2.1恶转过程中miR-218表达情况如下:25代之前,四组细胞中miR-218表达水平与0代相比,基本保持不变;25代之后,HPV+MNNG组和MNNG组细胞中miR-218表达水平迅速上升;40代之后,miR-218在四组细胞中的表达均呈下降趋势。2.2 CCK-8结果显示,miR-218 mimic转染24h时,miR-NC组和miR-218组恶转细胞活性分别为1.45±0.02、1.42±0.14,差异无统计学意义(P>0.05);转染48h时,miR-218组细胞活性(1.99±0.18)低于miR-NC组(2.33±0.05)(P<0.05)。2.3 Transwell迁移实验结果显示,miR-NC组和miR-218组穿透微孔膜的细胞数分别为85.33±5.03、54.33±5.13(P<0.05);Transwell侵袭实验结果显示,miR-NC组和miR-218组穿过的细胞数分别为207.67±7.77、151.67±7.64(P<0.05)。2.4细胞周期分析结果显示,miR-218组和miR-NC组S期细胞所占比例分别为(34.15±1.09)%、(24.57±1.07)%(P<0.05),G2期分别为(27.01±1.51)%、(36.24±2.17)%(P<0.05)。2.5 AnnexinV-PI双染检测结果显示,miR-NC组和miR-218凋亡率分别为(15.23±0.41)%、(14.29±0.58)%,差异无统计学意义(P>0.05)。二、miR-218在食管细胞恶性转化中的作用机制采用Illumina测序技术对恶转细胞进行转录组学测序,对差异表达基因进行GO功能注释和Pathway分析,使用STRING数据库分析差异表达基因之间的互作关系,互作网络由Cytoscape软件实现可视化。应用miRNAs靶基因预测软件(TargetScan/Pictar/miRDB)对miR-218功能靶基因进行预测,采用RT-qPCR、Western Blot和双荧光素酶报告基因实验对miR-218靶基因进行验证。1.恶转细胞的转录组学分析1.1 DEGs分析结果显示,与对照组相比,HPV+MNNG组差异表达基因604个,MNNG组2462个,HPV组247个。1.2 GO分析结果显示,与对照组相比,HPV+MNNG组差异基因主要富集到对病毒的防御反应、细胞趋化性等,MNNG组差异基因主要富集在血管形态发生、血管再生等肿瘤形成过程,HPV组差异基因富集在炎症反应过程,如中性粒细胞趋化性、对I型干扰素的反应、细胞因子活性。1.3 KEGG信号通路分析显示,与对照组相比,HPV+MNNG组差异基因主要富集在TNF signaling pathway、Influenza A、NF-kappa B signaling pathway,MNNG组差异基因主要富集与在肿瘤发生直接相关的信号通路,如Pathways in cancer,HPV组差异基因富集在IL-17 signaling pathway。1.4差异基因的蛋白互作网络图中基因的节点大小与其产物作用能力大小呈正相关。与对照组相比,HPV+MNNG组差异基因中EGR1、JUN、FOS、IL8、TNF的节点较大,MNNG组中基因JUN、FOS、FYN、SMAD3的节点较大,HPV组中基因EGR1、JUN的节点较大,提示以上基因产物的作用能力较大。2.miR-218靶基因筛选及验证2.1采用miRNA靶基因预测软件(TargetScanHuman7.2/miRDB/Pictar)对miR-218靶基因进行在线预测,取这三个软件预测结果的交集,得到134个靶基因。2.2 HPV+MNNG组差异表达基因604个,与上述134个靶基因再次取交集,最终获得7个基因(ELMO1,NPAS2,ITM2C,GAB2,CNTNAP2,MDGA1,SOCS3)。2.3采用生物信息数据库GeneAnalytics对以上7个基因进行GO功能注释和Pathway分析,发现其中4个基因(ELMO1,NPAS2,GAB2,SOCS3)参与肿瘤发生发展的多个环节,进一步查阅肿瘤相关文献,最终确定两个与肿瘤关系最为密切的基因,即GAB2和SOCS3。2.4 RT-qPCR和Western Blot结果显示,转染miR-218 mimic可降低GAB2、SOCS3在mRNA和蛋白水平上的表达。双荧光素酶报告基因实验结果显示,GAB2-WT+miR-218 mimic转染组荧光素酶活性与GAB2-WT+miR-NC转染组和GAB2-MUT+miR-218 mimic转染组相比,分别减少了52.44%和48.68%,从而表明在恶转细胞中GAB2是miR-218的直接靶基因。3.miR-218通过靶向GAB2调控SHP2/ERK和Akt/mTOR通路3.1 CCK-8结果显示,恶转细胞转染si-GAB2(si-GAB2组)72h和96h后细胞增殖活性低于阴性对照组(P<0.05)。3.2 Transwell迁移实验结果显示,si-NC组和si-GAB2组穿透微孔膜的细胞数分别为47.33±1.53、16.67±1.52(P<0.05);Transwell侵袭实验结果显示,si-NC组和si-GAB2组穿过的细胞数分别为38.00±1.00、16.00±1.00(P<0.05)。3.3采用Western Blot法检测SHP2/ERK和Akt/mTOR通路中关键蛋白的表达水平。结果显示,恶转细胞转染si-GAB2后,SHP2/ERK通路中SHP2、ERK、p-ERK蛋白表达量减少,Akt/mTOR通路中的Akt、mTOR、p-mTOR蛋白表达水平下降。三、人群HPV感染及miR-218表达水平分析采用ELISA方法对血浆中HPV感染状况进行定性检测,miRNeasy Serum/Plasma Kit试剂盒提取血浆总RNA,RT-qPCR对血浆中miR-218和GAB2的表达水平进行检测。1.ELISA检测结果显示,50例病例中有3例HPV为阳性,阳性率为6%,50例对照HPV均为阴性(P>0.05)。2.RT-qPCR结果显示,与对照相比,食管癌患者血浆中miR-218的表达水平呈下降趋势(P>0.05),而GAB2相对表达水平较高,其表达量相当于对照组的2.86倍(P<0.05)。结论:1.miR-218在食管癌细胞中低表达;过表达miR-218可抑制食管癌细胞EC109的增殖、迁移和侵袭,促进细胞凋亡。2.过表达miR-218可抑制食管恶转细胞的增殖、迁移和侵袭,阻滞细胞在S期。3.HPV+MNNG组差异基因主要富集在TNF signaling pathway、Influenza A、NF-kappa B signaling pathway,MNNG组富集在Pathways in cancer、Basal cell carcinoma等与肿瘤发生直接相关的信号通路,HPV组富集在IL-17信号通路。4.食管恶转细胞中GAB2是miR-218的直接靶基因之一。5.HPV联合MNNG致食管上皮细胞恶性转化中,miR-218可能是通过靶向调控GAB2的表达,进而激活GAB2下游相关信号转导通路SHP2/ERK和Akt/mTOR,参与调控细胞恶性转化过程。