论文部分内容阅读
胃癌是危害人类健康最常见的恶性肿瘤之一,其发病率高,预后差。化疗是治疗胃癌的重要策略之一,但是传统的化疗在临床应用中存在治疗效果差,副作用大等问题。这主要是因为传统化疗多为全身给药,缺乏靶向性和控释性,无法在肿瘤局部达到有效的药物浓度,同时相对较高的全身血药浓度则会引起诸多不良反应,而肿瘤多药耐药(MDR)的产生更是严重降低了化疗的治疗效果。脂质体(LP)是一种优良的药物或基因载体,根据其不同特点,可以分为很多种,本研究拟整合其中磁性脂质体(ML),热敏脂质体(TSL)和阳离子脂质体(CL)各自的特征,设计一种同时具有磁靶向性和热敏控释性的药物和基因共传递载体,使其不仅能同时传递药物和基因,而且能分别在体外定向磁场和交变磁场的作用下实现肿瘤局部磁靶向定向运输和热敏触发药物控释。我们将从热敏性,磁响应性及基因传递能力三个方面进行研究,完成这种新型载体的构建；然后将多柔比星(DOX)和编码SATB1-shRNA的质粒装入载体,从DOX的热敏释放率,SATBl基因沉默效果,DOX及SATB1-shRNA磁靶向传递效率,体外细胞毒性作用和凋亡诱导以及体内抑瘤实验等方面检验其对于胃癌的治疗效果。本文将从脂质体处方筛选及热敏控释特征研究,磁性载药系统制备及磁响应性研究,基因传递性能及转染条件优化,多柔比星和SATB1-shRNA阳离子载药系统的制备及表征研究和体内外抑瘤实验研究五个方面,对这种新型热敏磁靶向阳离子载药系统的制备及其共传递多柔比星和SATB1-shRNA在胃癌中的治疗效果进行研究。第一部分热敏阳离子载药系统的处方筛选及热敏控释特征研究[摘要]目的：筛选可以用于药物与基因共传递的热敏阳离子脂质体处方,并鉴定其正电性和热敏性。方法：以DPPC为主要材料,通过加入胆固醇及多种阳离子成分设计3种处方,TSL:DPPC:Chol=80:20, CL:DPPC:DC-Chol:Chol=80:10:10以及TSCL:DPPC:DC-Chol:DOAB:Chol=80:5:5:10(摩尔比),采用薄膜分散水化法分别制备脂质体；通过激光粒径分析仪检测脂质体的粒径,多分散性及表面电位；通过Calcein释放实验和DSC鉴定脂质体的热敏性。结果：CL和TSCL均表面带有正电荷,而TSL呈电中性；TSL, CL和TSCL在42℃均能实现Calcein的热敏释放,CL在37℃存在Calcein的提前释放,而TSL及TSCL在37℃保持稳定；DSC结果显示TSL的Tm值为41.6℃,CL为38.2℃, TSCL为40.8℃。结论：结合表面电位和热敏检测,我们可以确定TSCL处方,即DPPC:DC-Chol:DOAB:Chol=80:5:5:10同时具备良好的正电性和热敏性,可以作为热敏阳离子载药系统的处方。第二部分热敏磁性阳离子载药系统的制备及磁响应性研究[摘要]目的：在TSCL处方的基础上,通过包封Magnetic FluidFe3O4制备TSMCL,并鉴定其形态和磁响应性特征。方法：以DPPC:DC-Choi:DOAB:Chol=80:5:5:10为处方,以Magnetic FluidFe3O4为核心,采用薄膜分散水化法制备TSMCL；通过激光粒径分析仪检测Magnetic FluidFe3O4, TSCL及TSMCL的粒径,多分散性和表面电位；通过TEM观察性Magnetic FluidFe3O4, TSCL及TSMCL的表面形态；通过VSM检测Magnetic FluidFe3O4的定向磁场响应性；通过记录Magnetic FluidFe3O4及TSMCL在交变磁场作用下的升温曲线,并计算其比吸收率(SAR),检测其对于交变磁场响应性。结果：TSMCL较TSCL粒径显著增大(P<0.05),但是表面电位无明显差异；TEM显示Magnetic FluidFe3O4具有纳米磁铁颗粒的特点,.TSCL及TSMCL具有典型的脂质体形态特征；VSM显示Magnetic具有超顺磁性特征；升温曲线显示Magnetic和TSMCL均能在20min内由25℃升温至42℃,Magnetic FluidFe3O44的SAR为25.4W/gFe, TSMCL为28.3W/gFe。结论：Magnetic FluidFe3O4具有较小的粒径,良好的多分散性,理想的定向磁场和交变磁场响应性；其制备的TSMCL具有良好的磁靶向性和交变磁场触发热敏控释性。第三部分热敏磁性阳离子载药系统基因传递性能及转染条件研究[摘要]目的：鉴定TSL, CL, TSCL及TSMCL的基因传递能力,并优化转染条件方法：根据TSL, CL, TSCL处方分别制备包封PBS的脂质体,根据TSCL处方制备包封不同浓度Magnetic的TSMCL (0.5mg/ml)和TSMCL (1mg/ml);通过激光粒径分析仪检测脂质体的粒径,多分散性及表面电位；通过凝胶阻滞实验检测脂质体吸附pDNA的能力；使用脂质体装载pGPU6/GFP质粒进行体外细胞转染实验,通过荧光显微镜和流式细胞仪检测GFP的表达水平；通过DNA与脂质体的N/P比,转染复合物孵育时间,Magnetic Fluid Fe3O4浓度及磁场诱导时间优化转染条件。结果：激光粒径分析仪检测显示TSMCL (1mg/ml)的粒径较TSMCL (0.5mg/ml)显著增大(P<0.05),脂质体吸附pDNA后粒径显著增大(P<0.05)；凝胶阻滞实验显示TSL没有吸附DNA的能力,而CL, TSCL和TSMCL均有一定的吸附DNA的能力；体外转染实验显示TSL没有转染能力,而CL, TSCL具有一定的转染能力；N/P比为5,孵育时间为6h, TSMCL (0.5mg/ml),定向磁场作用30min时的转染效率最高。结论：TSL没有转染能力,而CL,TSCL及TSMCL具有传递基因的能力；当N/P比为5,孵育时间为6h, TSMCL (0.5mg/ml),定向磁场作用30min时转染效率最高。第四部分热敏磁性阳离子多柔比星和SATB1-shRNA共传递载药系统的制备及鉴定[摘要]目的：将DOX和编码SATB1-shRNA的质粒装入TSCL及TSMCL中,鉴定DOX热敏释放率,SATB1基因沉默效果及磁靶向DOX和SATB1-shRNA传递效率。方法：采用硫酸铵梯度法将DOX装入脂质体中,通过静电吸附作用装载编码SATB1-shRNA的质粒,构建DOX和SATB1-shRNA共传递载药系统；通过激光粒径分析仪检测其粒径,多分散性及表面电位；通过荧光分光光度计检测DOX的装载效率；通过DOX释放实验检测DOX的热敏释放率；通过RT-PCR及Western-blot检测SATB1基因的靶向沉默效果；通过荧光显微镜观察DOX和SATB1-shRNA的细胞摄取率。结果：DOX的装载率,对于TSCL-DOX为89±3%,TSMCL-DOX为78±8%,TSCL-DOX-shSATB1为85±7%,TSMCL-DOX-shSATB1为73±9%;DOX脂质体在37℃均保持稳定,在42℃存在热敏释放,且装载SATB1-shRNA对于DOX的热敏释放没有显著的影响：传递SATB1-shRNA能够沉默SATB1的表达；通过磁靶向能够显著增强DOX及SATBl-shRNA的细胞摄取量及基因沉默效果。结论：热敏磁性多柔比星和SATB1-shRNA阳离子共传递载药系统具有理想的DOX装载率,DOX热敏释放率,良好的SATB1基因沉默效果及磁靶向DOX和SATB1-shRNA传递能力。第五部分热敏磁性阳离子多柔比星和SATB1-shRNA共传递载药系统靶向治疗胃癌实验研究[摘要]目的：检测热敏磁性DOX和SATB1-shRNA共传递载药系统对于胃癌的治疗效果。方法：通过MTT实验检测其对于胃癌细胞的细胞毒作用；通过AnnexinV-FITC和PI双染检测细胞凋亡；通过胃癌荷瘤鼠模型检测体内抑瘤效果。结果：体外实验显示DOX, TSCL-DOX, TSMCL-DOX, TSCL-shSATB1, TSMCL-shSATB1, TSCL-DOX-shRNA, TSMCL-DOX-shRNA的细胞存活率分别为40.3±3.4%,73.6±3.5%,51.3±4.5%,79.2±6.9%,71.6±4.7%,35.0±3.2%和22.3±3.4%；细胞凋亡率分别为22.3%,8.9%,13.4%,9.4%,17.4%,27.7%和32.4%；体内抑瘤实验显示空白组,Free DOX组,TSMCL-DOX组,TSCML-shSATB1组,TSCL-DOX-shSATB1组及TSMCL-DOX-shSATB1的肿瘤大小分别为2.14±0.23cm3,1.08±0.13cm3,0.68±0.10cm3,1.43±0.21cm3,0.77±0.12cm3和0.44±0.05cm3。结论：通过热敏磁性阳离子载药系统共传递DOX及SATB1-shRNA可以产生协同抗肿瘤作用。