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血红素加氧酶(heme oxygenase, HO, EC1.14.99.3)(?)催化血红素降解第一步反应中的重要限速酶,其催化血红素降解形成CO、胆绿素及二价铁离子。HOs在植物中的主要功能是参与光敏色素前体的合成,在植物光形态建成中发挥重要的作用。近年来研究发现植物HOs在抗氧化胁迫中具有重要的生理及调节功能。目前,HOs编码基因已从许多植物中获得克隆,但重要的油料作物油菜中尚未见有报道。基于同源克隆及RACE扩增的方法,我们在油菜中克隆了三条HOs的编码序列(BnHO1-3)。BnHO1基因开放阅读框(open reading frame, ORF)为846bp,编码281个氨基酸；BnHO2基因ORF为879bp,编码293个氨基酸；BnH03基因ORF为849bp,编码282个氨基酸。BnHO1-3(?)勺C-末端均包含HO保守的结构域。氨基酸序列比对揭示BnHO1和BnHO3存在较高的一致性(78.6%),而与BnHO23勺一致性较低,分别为42.52和41.98%。通过与AtHO1-4的序列比较及植物HOs的进化分析发现,BnHO1-3可分为两个亚家族,BnHO1和BnHO3属HO1-like亚家族,BnHO2属HO2亚家族。BnHO1, BnHO2和BnHO3DNA序列长度分别为1188bp,1527bp和1241bp。BnHO1和BnHO3具有三个外显子,与AtHO1结构相似。而BnHO2具有四个外显子,结构类似于AtHO2。BnHO1-3基因转录水平分析表明其在子叶、下胚轴及幼苗的茎、根、真叶中均有表达。其中,BnHO1的转录水平最高,BnHO3次之,BnHO2的转录水平最低。BnHOs转录最活跃的组织是子叶,其次为真叶,在根中转录水平最低。汞(mercury, Hg)已经成为我国农田和水体有毒重金属污染的主要来源之一,对植物细胞具有很强的毒性。汞对植物细胞主要毒害作用是通过激发活性氧(reactive oxygen species, ROS)勺大量产生,造成植物体氧化胁迫伤害。实验发现,在Hg胁迫下油菜根系硫代巴比妥酸反应物(thiobarbituric acid reactive substances, TBARS)含量增加,脂质过氧化损伤程度增加。Hg胁迫同样也可以造成油菜根系中植物螯合素合成酶(phytochelatin synthasel, PCS1, EC2.3.2.15)基因表达上调。PCS1可催化植物螯合素(phytochelatins, PCs)产生,通过螯合作用消除过量金属离子对植物体的伤害。为了研究BnHOs基因对Hg的响应规律及在汞胁迫下对细胞保护作用,我们首先研究BnHOs基因在Hg处理下的表达情况。结果发现,BnHO1转录水平可受Hg诱导显著上调,而BnH02转录水平在Hg胁迫下不改变,BnH03在汞胁迫下转录水平有所提高,但只有在高浓度Hg(40μM)处理下才达到显著差异。我们使用高铁血红素(Hematin, Ht),胆红素(Bilirubin, BR),一氧化碳(Carbon monoxide, CO)及锌原卟啉(Zn-protoporphyrinIX, ZnPPIx)等对Hg胁迫下的油菜根系进行处理。Ht是HO的底物,可诱导内源HO转录水平增加。而CO、BR是HO的产物,可模拟内源HO表达活性增加时的生理状态。结果显示,外源添加CO、BR及Ht均可以有效地降低Hg胁迫造成油菜根系TBARS的含量,缓解Hg胁迫造成的脂质过氧化作用。ZnPPIx是HO酶活性的竞争抑制剂。在添加ZnPPIx的Hg处理中,油菜根系的TBARS含量进一步增加,脂质过氧化染色及质膜透性染色程度也有所加深。Ht及BR也能使Hg胁迫下BnPCS1基因转录水平下降,而ZnPPIx使Hg胁迫下BnPCS1基因转录水平增加。BnHO1在添加Ht的Hg处理下受底物及Hg的双重诱导而进一步上调。在Hg处理中添加BR时,由于BR自身的抗氧化缓解能力及对HOs反馈抑制作用, BnHO1的转录水平较仅在Hg处理下有较大程度的降低。而在ZnPPIx处理中,BnHO1转录水平始终受到很大程度抑制。由此我们可以得到结论,BnHO1可以在一定程度上可以缓解Hg对油菜根系造成的氧化胁迫伤害。为了进一步验证BnHO1在Hg胁迫下的功能,我们构建了35S驱动的BnHO1表达载体,并将其遗传转化烟草,通过PCR初步鉴定的目的BnHO1已导入烟草基因组,获得T0代的快繁芽苗及T2的纯和株系,进行汞胁迫的实验研究。过量表达BnHO1的T0代转基因烟草叶片对Hg胁迫下的过氧化氢(hydrogen peroxidase, H2O2)及超氧阴离子(superoxide anion, O2-)组织染色,显示转BnHO1基因烟草叶片着色程度低于对照。结果表明转BnHO1基因可以缓解烟草叶片的活性氧(ROS)的损伤。对转基因烟草在汞胁迫下生物量及汞含量进行分析,T0代及T2代均得到一致结果。即转BnHO1基因植株在汞胁迫下的干重均高于对照,Hg积累量要显著的低于野生型植株。此外,T2代转BnHO1基因烟草种子,在汞胁迫下具有较对照高的萌发能力。在对四个转BnHO1基因Tl代油菜植株株系进行Hg胁迫试验研究,也得到类似的结果。在汞胁迫下,转BnHO1基因油菜叶片的H2O2及O2-组织染色的着色程度低于对照。转BnHO1基因增加Hg胁迫下的油菜干物质积累量,根及叶中表现一致。对于转基因油菜根及叶组织中的Hg含量,较对照均表现为不同程度的降低。通过转基因烟草及油菜的Hg胁迫实验,可得到一致的结论：BnHO1基因可以有效缓解植物Hg胁迫下活性氧损伤,增加植物的干物质积累量,提高植物对Hg的耐受性。为了深入研究BnHO1基因受重金属的调控,我们运用热不对称PCR(Thermal asymmetric interlaced PCR, TAIL-PCR)技术,扩增出了1100bp的BnHO1基因上游启动子序列。BnHO1基因启动子经在线PlantCARE (cis-elements)预测,得到包括光响应及热激、干旱、机械损伤、ABA、茉莉酸、水杨酸及生长素等多个胁迫响应及激素诱导元件。随后,我们构建了BnHO1启动子驱动报告基因的表达载体,并通过农杆菌介导幼苗快速转化的方法(Fast agro-mediated seedling transformation, FAST)转化烟草,在转基因烟草中,通过GUS染色证实BnHO1启动子在植物中具有启动活性。基于同样方法,我们对BnHO1启动子对不同重金属响应进行分析。结果显示在Cd处理下,BnHO1启动子驱动效率略有降低,但差异未达到显著水平。在Hg、Cu、Zn处理下,BnHO1启动子启动效率显著增加,其中Zn处理下增加量最高,基本上高于对照一倍。而Pb处理下,BnHO1启动子启动效率明显下调。