热激蛋白(Heat Shock Proteins,HSPs)是一类维持细胞稳态的高度保守的蛋白超家族。哺乳动物研究表明,HSP70,一种被诱导的分子量为72 kDa左右的热激蛋白,不仅作为分子伴侣在蛋白折叠、跨膜运输和转位等方面发挥重要作用,还作为细胞因子参与机体先天和获得性免疫反应的调节。硬骨鱼HSP70基因在许多鱼类中被克隆鉴定,常被作为生理应急反应的生物标志物。同时,硬骨鱼HSP70也被初步发现可能具有细胞因子功能,例如在草鱼外周血淋巴细胞(PBLs)中存在胞外分泌形式,诱导促炎因子mRNA高表达等。与哺乳动物研究相比,硬骨鱼HSP70细胞因子功能相关信息还十分匮乏,尤其在膜受体鉴别、胞内信号转导通路及其在炎症条件下的调控作用等方面。因此,本论文围绕上述三个方面系统地对草鱼HSP70细胞因子功能进行研究,不仅为进一步研究哺乳动物HSP70同系物功能提供了线索,而且将阐明草鱼HSP70参与免疫反应调节的作用机制,从而获悉鱼类HSP70免疫学新内容,为其在鱼病防治方面的应用奠定基础。主要研究结果如下:1.草鱼HSP70是初期响应免疫刺激的重要细胞因子之一。(1)以草鱼头肾白细胞(HKLs)为细胞模型,在脂多糖(LPS)刺激下检测细胞内HSP70 mRNA表达,发现有剂量和时间依赖的上升;(2)在鱼类研究中首次发现HSP70蛋白分泌对LPS的响应在刺激发生1小时就有显著差异,并存在累积效应,且早于LPS对其基因转录水平的调控。(3)在体实验发现嗜水汽单胞菌感染刺激草鱼头肾组织中HSP70 mRNA和蛋白的表达,而外周血中HSP70蛋白含量增加更明显。这些结果显示草鱼HSP70在免疫刺激初期就以胞外分泌形式参与免疫响应,承担免疫调控作用。2.草鱼HSP70调控其它参与炎症调节的细胞因子的mRNA表达和蛋白分泌。(1)在草鱼HKLs细胞中重组草鱼HSP70蛋白(rgcHSP70)上调促炎因子肿瘤坏死因子-α(TNF-α)和白细胞介素-1β(IL-1β)的mRNA表达水平,同时刺激抑炎因子IL-10的产生,但对另一个抑炎因子转化生长因子(TGF-β)mRNA表达无影响。这一结果与哺乳动物研究结果有一定差异,显示草鱼HSP70的功能特异性。(2)草鱼HSP70促进细胞培养液中TNF-α、IL-1β和IL-10的分泌,其中对TNF-α和IL-1β分泌的调节发生很快,而对IL-10分泌的影响是持续和长久的。这些工作在鱼类中首次发现HSP70对细胞因子分泌的调控。3.草鱼HSP70通过不同信号通路调节抑炎因子和促炎因子的转录。(1)草鱼HSP70对TNF-α,IL-1β的调控均与NF-κB信号通路相关,同时p38 MAPK信号通路参与对IL-1β的调控,而JNK MAPK信号通路参与TNF-α的调控。(2)草鱼HSP70对IL-10的调控与NF-κB信号通路无关,只与p38 MAPK信号通路有关。4.初步鉴定草鱼HSP70受体。(1)用生物信息学方法分析草鱼HSP70和TLR4在空间结构上可能形成相互作用。(2)克隆草鱼TLR4编码序列,构建TLR4真核表达质粒,在草鱼肾细胞系CIK中,通过NF-κB报告质粒的荧光素酶活性检验证明HSP70能够通过TLR4促进NF-κB活性,用实验方法证明了草鱼TLR4是草鱼HSP70的候选受体之一。这些结果初步鉴定了草鱼TRL4是草鱼HSP70的受体,相应提示鱼类TLR4的配体是HSP70。5.草鱼HSP70参与炎症调控的机制探讨。以嗜水气单胞菌感染的草鱼个体为研究模型发现:(1)rgcHSP70对嗜水气单胞菌造成的草鱼个体的死亡具有一定程度的保护作用。(2)rgcHSP70增强草鱼体内多种抗氧化酶活性,从而提高机体抗氧化能力。(3)rgcHSP70能快速调节细胞因子表达,增强鱼体抵抗细菌性病原的免疫力。(4)rgcHSP70通过对促炎因子IL-10持续的调控保护机体。这些研究探讨草鱼HSP70对炎症调控的相关机制以及潜在应用。总之,本论文从草鱼HSP70对炎症调控的响应以及草鱼HSP70对细胞因子调控模式、介导的信号通路、受体鉴定以及对炎症的调控等方面,系统地探究了低等脊椎动物中HSP70的细胞因子功能,不仅明确并完善HSP70在低等动物免疫系统的免疫学地位,而且通过揭示硬骨鱼HSP70的作用机理获悉鱼类炎症调控机制的新信息,进而提供鱼类免疫防御的新线索。