【目的和意义】造血干细胞移植(Hematopoietic Stem Cell Transplantation, HSCT)是目前治疗恶性血液病的最有效方法之一,供者和患者人类白细胞抗原系统(Human Leukocyte Antigen, HLA)相合与否被认为是影响造血干细胞移植成败的决定性因素。但是,即使是在HLA高分辨基因分型全相合的造血干细胞移植中,移植预后在受者间也存在着很大的差异。因此,近年来,除了HLA基因相合外,自然杀伤细胞(Natural Killer, NK)受体系统日益受到关注。杀伤细胞免疫球蛋白样受体(killer Ig-like receptor, KIR)是表达在NK细胞及部分T细胞表面的一类受体,在异基因造血干细胞移植中起着重要的作用。KIR基因的分布在不同人种不同个体间存在很大的差异,目前尚缺乏对中国汉族人群KIR基因分布规律的了解,因而,研究KIR基因遗传学背景的差异对进一步探讨其对疾病的影响具有重要意义。KIR基因有两种单体型:单体型A和单体型B。单体型A存在唯一的活化型受体基因2DS4,其中只有2DS4*001 (包括2DS4*0010101、*0010102、*0010103、*00102、*00103)编码NK细胞表面有功能的受体,其他等位基因(如2DS4*003, *004, *006, *007, *008,*009)在第5外显子有22个碱基的缺失,导致移框突变使其所编码的蛋白缺失了跨膜区和胞内区,从而无法锚定在细胞膜上,以功能尚不明确的游离蛋白的形式存在。但是,到目前为止,国内外尚无针对KIR2DS4基因与造血干细胞移植相关的研究。随着对KIR受体识别和杀伤肿瘤细胞重要作用的不断了解,人们逐渐认识到供者KIR与受者HLA遗传背景影响了HSCT预后,由抑制型KIR (inhibitory KIR receptors, iKIR) -HLA“错配模式”引起的NK细胞异源反应性在HSCT中促进移植物植入以及增强移植物抗白血病效应(graft-versus-leukemia, GVL)的作用,已经成为国内外学者研究的热点。同时,供者来源的活化型KIR受体(activating KIR receptors, aKIR)传导的活化信号对NK细胞活性的调节可能起到在临床治疗中如何控制移植物抗宿主病(graft-versus-host disease, GVHD)和调节移植物抗白血病效应的作用。【方法】研究对象为150例中国汉族人,75对接受异基因造血干细胞移植的供者及受者,患者白血病分型为ALL29例、CML24例、AML19例、其他恶性血液病3例。此项研究共分为三部分:⑴采用基因测序(Sequence-based typing, SBT)对HLA-A, -B, -C, -DRB1和-DQB1位点进行高分辨分型;采用序列特异性引物聚合酶链反应(PCR-sequence-specific primers PCR-SSP)进行KIR基因分型,研究了KIR基因以及KIR单体型在中国汉族人群中的分布情况以及与其他人种进行了比较,并且在此基础上分析了供者KIR和受者HLA的配受体关系。⑵建立了SBT结合TOPO TA克隆的方法对2DS4等位基因进行全长测序,证实了2DS4完整型与缺失型等位基因的存在,研究KIR2DS4等位基因在中国人群中的分布,分析了中国人群KIR2DS4等位基因的分布特点并发现了三个新等位基因。⑶建立了供者KIR-受者HLA的配受体模式,分析了“缺失配体”模式对异基因HSCT预后的影响;采用实时定量PCR (Real-time PCR),对30例存在“缺失配体”的移植动态随访了受者体内KIR2DL1、2DS1、3DL1和3DS1基因在移植后的mRNA表达;并结合临床资料,分析KIR单体型对移植预后的影响,同时进一步分析了其中35例供者为KIR单体型A纯合的移植中供者来源2DS4等位基因与移植后急性GVHD发生的关系,并且从转录水平研究了KIR2DL1/3DL1基因与异基因HSCT预后的相关性。【结果】⑴17种KIR基因均能够被检测出,比例从21.3%至100%不等,所有样本都存在框架基因3DL3、3DP1、2DL4和3DL2,除框架基因以外,2DL1和2DP1是在中国汉族人群中分布最广的基因,而比例最低的是2DL2和2DS3;44.0%的个体KIR分型为A/A,56.0%的个体KIR分型为B/x。KIR基因与KIR单体型在中国汉族人群中的分布比例与日本人群相似,而与高加索人群和非洲裔美国人群存在较大差异。⑵分析供者抑制型KIR受体与受者HLA配体分子,75例移植中有53例供者存在KIR2DL1基因而受者没有HLA-C2组位点;2例供者存在KIR2DL12/L3基因而受者没有HLA-C1组位点;24例供者存在KIR3DL1基因而受者没有HLA-Bw4位点。⑶中国汉族人群在KIR基因及2DS4等位基因分布上具有其独特性。150例样本中139例(92.7%)存在KIR2DS4基因,对2DS4基因全长测序后发现4个2DS4等位基因:KIR2DS4*00101、*003、*004和*007;78.4%(109/139)的个体存在2DS4*00101;2DS4缺失型(个体存在1个或缺失2DS4*00101基因)与完整型(个体存在两个2DS4*00101基因)的存在比率为1:2。在139例2DS4阳性的个体中,66例KIR分型为A/A,73例KIR分型为B/x型。在A/A组中,42.4% (28/66)的个体为完整型/缺失型2DS4杂合,明显高于B/x组(11.0%, 8/73);12.1% (8/66)的个体为缺失型2DS4纯合,这个比例在B/x组中为30.1% (22/73)。发现了3个KIR2DS4新基因。⑷研究KIR基因对75例进行HSCT预后的影响,60例移植供受者均为HLA-A, -B, -C, -DRB1, -DQB1位点高分辨全相合,15例有单个HLA-C等位基因分型不相合。存在“缺失配体”模式的移植在A/A组和B/x组中所占的比例分别为88.6%和87.5%。采用多因素分析研究“缺失配体”模式移植的比例对移植预后的影响没有发现统计学差异。75例移植中,当供者KIR分型为B/x (n=40)时,移植后总体生存率(Overall survival, OS)要明显高于供者为A/A组(n=35) (RR 3.1 [95% CI 1.1-8.6], P= 0.007)。在其中35例供者为KIR单体型A/A纯合的移植中,当供者2DS4等位基因为完整型(n=14)时,移植后急性GVHD的发生率要明显高于供者2DS4等位基因为缺失型(n=21)的情况(RR 9.0 [95% CI 1.2-66.9], P= 0.010),其中以Ⅲ-Ⅳ度aGVHD尤为明显(P=0.006)。Real-time PCR动态随访患者移植后2DL1、2DS1、3DL1和3DS1基因mRNA表达水平发现:发生aGVHD的患者组在移植后30-90天,2DL1和3DL1和的mRNA拷贝数相比无aGVHD组明显升高(P值分别为0.021和0.005);当供者与受者均为KIR单体型A纯合时,这一差异更为显著:在发生aGVHD的患者组与不发生aGVHD的患者组之间,比较移植后90天时KIR2DL1和3DL1基因的mRNA表达水平,具有统计学上的差异(z=2.558, P=0.011)。结果提示,移植早期(<90天) KIR2DL1和3DL1基因的mRNA高表达与aGVHD的发生呈正相关。【结论】中国汉族人群在KIR基因及2DS4等位基因分布上具有独特性;供者为KIR单体型(B/x)的移植预后较好;供者来源完整型2DS4等位基因以及患者移植早期2DL1和3DL1基因mRNA高表达增加了移植后aGVHD的发生风险。因此,移植前在HLA分型的基础上结合KIR基因分型和KIR2DS4等位基因分型,可能对临床上选择合适的供者提供有利依据;移植后动态随访患者KIR2DL1/3DL1基因mRNA表达有利于预测aGVHD的发生;探索供者KIR和受者HLA遗传背景与异基因造血干细胞移植预后的关系,为遗传学指标指导下供者的优化选择提供分子依据,也为临床制定治疗方案提供参考。