第1章NOD2上调人主动脉内皮细胞Ⅰ类干扰素基因的表达　　 研究背景:胞壁二肽(MDP)是一种病原体相关分子模式（PAMPs），MDP可以被胞浆核酸结合寡核苷酸域-2(NOD2)识别。NLRs是在动物体内新发现的固有免疫分子，最先报道的通过对PAMPs刺激起反应而发挥微生物分子识别功能的NLRs就是NOD1(CARD4)和NOD2(CARD15)，NLRs可影响动脉粥样硬化进程。有报道称Ⅰ类干扰素家族与人类动脉粥样硬化斑块的不稳定性有关。MDP能直接诱导细胞因子，包括干扰素的产生，激活并调节免疫和炎症反应。我们发现MDP能诱导HAECs表达Ⅰ类干扰素，但其机制尚不清楚。　　 目的:观察MDP对HAECsⅠ类干扰素表达的影响，探讨MDP通过NOD2上调HAECsⅠ类干扰素基因的表达的机制，讨论MDP对HAECs其它炎症因子表达的影响。　　 方法:按实验要求用MDP处理HAECs，用RT-PCR、qRT-PCR测定HAECs IFN-α，IFN-β，IL-1β，IL-8和MCP-1基因的表达。用RT-PCR技术测定与MDP诱导HAECsⅠ类干扰素表达相关的基因NOD1，NOD2，TNF-α，IRFs表达，用Western-blot技术进一步研究其机制。　　 结果:　　 1.用不同浓度（0、0.1、0.5、1、5、10μg/ml）的MDP处理HAECs24小时，测定IFN-α与IFN-β基因的表达，发现MDP呈剂量依赖的上调Ⅰ类干扰素的表达。　　 2.用10μg/ml的MDP处理HAECs不同时间(0、1、3、6、12、24h),测定IFN-α与IFN-β基因的表达，发现MDP呈时间依赖的上调Ⅰ类干扰素的表达。　　 3.用不同浓度(0、0.1、0.5、1、5、10μg/ml)的MDP处理HAECs24小时，测定NOD2基因的表达，可使NOD2基因表达上调。　　 4.用不同浓度(0、0.1、0.5、1、5、10μg/ml)的MDP处理HAECs24小时，测定NOD1基因的表达，可使NOD1基因表达下调。　　 5.用不同浓度(0、1、5、10、50、100ng/ml)的TNFα处理HAECs24小时，测定IFNα和IFNβ基因的表达，发现TNFα呈剂量依赖的上调IFNα和IFNβ基因的表达。　　 6.用不同浓度（0、0.1、0.5、1、5、10μg/ml）的MDP处理HAECs24小时，用RT-PCR测定TNFα基因的表达，发现基本无TNFα基因表达。　　 7.用不同浓度（0，0，2，10，0，10μg/ml）的TNFα中和抗体预处理HAECs30分钟，再用0，10μg/ml MDP及0，5ng/ml TNFα干预24小时，用qRT-PCR测定IFNs的表达，结果发现TNFα中和抗体不能降低MDP诱导的Ⅰ类干扰素表达。　　 8.用RT-PCR检测HAECs IRFs基因的表达，发现HAECs表达IRF1，2，3，9，但是基本上不表达IRF4，5，6，7，8。　　 9.用10μg/ml MDP处理HAECs不同时间(0、5、10、30、60、120min)，发现MDP在5分钟、10分钟及30分钟时诱导了IRF3的磷酸化。半定量分析结果显示与对照组相比较磷酸化的IRF3显著增加发生在5分钟、10分钟、30分钟和60分钟。　　 10.用不同浓度（0、0.1、0.5、1、5、10μg/ml）的MDP处理HAECs24小时，测定炎症因子基因的表达，发现MDP呈剂量依赖性的上调炎症因子包括:IL-1β，IL-8和MCP-1的表达。　　 结论:MDP可以通过IRF3途径上调HAECsⅠ类干扰素基因的表达，MDP呈剂量依赖性的上调炎症因子包括:IL-1β，IL-8和MCP-1的表达。　　 第2章Poly(I-C)诱导人脐静脉内皮细胞凋亡　　 研究背景:动脉粥样硬化是一种炎症性疾病，已知多种TLRs如TLR1、TLR2、TLR4、TLR9等与动脉粥样硬化关系密切。TLR3是TLRs家族的第一个成员，其作为一种模式识别受体(pathogen recognitionreceptors，PRRs)，被认为用来识别一种保守的病毒分子形态即双链RNA，TLR3在多种细胞广泛表达，但是尚未有报道认为其与动脉粥样硬化存在相关性。TLR3可介导多种肿瘤细胞凋亡，我们发现TLR3还可以通过内源性和外源性的凋亡途径介导血管内皮细胞凋亡从而损伤内皮功能。　　 目的:研究人工合成的dsRNA类似物Poly(I-C)对HUVECs生物学功能的影响，探讨固有免疫系统中PRRs在Poly(I-C)诱导的HUVECs凋亡过程中的作用及其机制。　　 方法:按要求用poly(I-C)处理原代的或者永生化HUVECs，用流式细胞仪分析HUVECs的凋亡情况，用RT-PCR、qRT-PCR及流式细胞技术检测TLR3及一些炎症因子的表达。进一步用Westem blot、ELISA、RT-PCR、RNA干扰等技术观察poly(I-C)对内源性及外源性凋亡途径中相关细胞因子的表达的影响。　　 结果:　　 1.流式细胞技术发现用poly(I-C)干预HUVECs24小时，可见早期凋亡、晚期凋亡逐渐增多，TLR3中和抗体和siRNA转导能显著抑制poly(I-C)诱导的细胞凋亡，p63下调抑制poly(I-C)诱导的HUVECs细胞凋亡。　　 2.RT-PCR还显示HUVECs表达低水平的TRAIL，DR4和DR5，poly(I-C)呈剂量依赖方式上调TRAIL及其受体（DR4和DR5）的表达，呈剂量依赖的下调Bcl-2基因的表达，上调BH3基因表达，上调TAp63α基因表达，p63RNA干扰抑制HUVECs TRAIL，DR4，和DR5的表达。　　 3.West-blot技术发现poly(I-C)上调HUVECs TLR3蛋白的表达，在5-10μg/ml poly(I-C)干预的细胞时其TLR3蛋白表达水平较低，poly(I-C)下调Bcl-2蛋白的表达，上调BH3蛋白表达，上调TAp63α的表达，TLR3 shRNA下调TLR3并抑制HUVECsTAp63α的表达，显著抑制Bcl-2的下调和Noxa的上调，P63 RNA干扰下调HUVECs Bcl-2的表达，上调Noxa的表达，抑制HUVECs caspases8、9和PARP的激活。　　 4.实时定量RT-PCR数据显示:poly(I-C)能显著上调HUVECs的TLR3基因表达。　　 5.ELISA结果显示poly(I-C)显著上调HUVECs TRAIL表达。　　 结论:poly(I-C)可诱导HUVECs凋亡，TLR3通过上调TAP63α激活死亡受体及线粒体途径诱导HUVECs细胞凋亡，损伤内皮功能。