论文部分内容阅读
(+)-γ-内酰胺酶能够特异性水解外消旋化合物Y-内酰胺,生成单一构型的(-)-γ-内酰胺。来源于Sulfolobus solfataricus P2 (SSOP2)中的(+)-γ-内酰胺酶具有高稳定性和高选择性,是理想的生物催化剂。本课题通过定点饱和突变与高通量显色相结合的方法对酶结构进行改造,进一步提高了酶的催化活性,使其具有更高的工业应用价值。由于SSOP2中的(+)-γ-内酰胺酶目前尚无晶型结构报道,我们通过同源建模、底物对接、动力学分析等进行分子模拟,并根据氨基酸的空间关系,分成三个阶段选取突变热点。(1)与催化三联体距离处于同一个螺旋或折叠的氨基酸:Ser181、Tyr183、Cys184、Ser110、Thr140、Ser175;(2)计算机模拟关键距离和能量有减小的氨基酸:Ser110、Ile336;(3)与Phe146空间距离较近的氨基酸:Va1383、Gly387及Ile452。对突变热点进行饱和突变,经过三轮筛选,最终得到对活性提高有影响的关键位点Ile336、Va1383,其中Ile336位点起到了重要的作用,突变体 I336R、I336H 活性最高,比酶活分别为 1249.43 U.mg-1 和 893.48 U·mg-1,相对于WT(205.87U·mg-1)活性提高6.07倍和4.34倍。Va1383位点中突变体V383N、V383Q对活性的促进作用较强。与实验室先前研究发现的V203N、Y388H两个阳性突变体进行组合构建多突变体,得到 V203N/Y388H/I336R/V383N 及 Y388H/I336R/V383N活性相对于WT分别提高了 5.01倍和5.25倍,双突变体Y388H/I336R(2839.36U.mg-1)提高了 13.79倍,V203N/I336R(3026.29U.mg-1)提高了14.70倍,三突变V203N/Y388H/I336R (3304.01 U·mg-1)活性最高,相对于WT提高了 16.05倍,催化效率Kcat/Km提高了 12.52倍。对阳性突变体的结构和能量进行分析,发现亲核进攻距离d3对活性影响较大。酶学性质研究发现,突变体并没有改变酶的热稳定性,在基本维持原有性质的基础上,活性提高。