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前言： 骨肉瘤是最常见的恶性骨肿瘤，好发于长骨的干骺端，早期即可出现转移，预后差。骨肉瘤的发生可能是由于多基因突变并长期积累所致，近年来的研究发现一些细胞周期调控相关因子也在骨肉瘤组织中异常表达，并可能在骨肉瘤的发生和发展中起着重要作用。 Cyclin G是细胞周期蛋白家族中的一名新成员，至今已鉴定出它有3个家族成员: cyclin G1、cyclin G2和cyclinⅠ，其中cyclin G1和cyclin G2在结构上有高度同源性，但在功能上似乎各自发挥着自己特有的生物学作用。人的cyclin G1基因定位在5q32-34，有6个外显子，第一个内含子中含有一个p53蛋白的结合位点(GCACACGCCCAGGCTAGTCC)，人的cyclin G1基因mRNA长2.8kb。cyclin G1mRNA在骨胳肌中表达水平最高，其次在卵巢、肾脏和结肠组织中也有较高水平的表达。现有的研究资料显示，cyclin G1在细胞增殖、细胞周期检查点调控和/或DNA修复中起作用，并参与诱导细胞凋亡过程，cyclin G1蛋白在细胞周期中随着G1早期至G1/S期最初表达上调，持续表达于整个细胞周期。有研究表明cyclin G1在肿瘤细胞的生长中起重要作用。 目的： 本研究采用多种方法检测cyclin G1在骨肉瘤组织中的表达以及脂质体转染cyclin G1反义脱氧寡核苷酸(ASON)对骨肉瘤细胞株OS-732增殖的调控作用。 方法： 1、应用免疫组化S-P法观察34例骨肉瘤及15例骨软骨瘤中cyclin G1的表达情况 连续石蜡切片脱蜡至水，3％过氧化氢孵育10分钟，以消除内源性过氧化物酶活;滴加正常血清室温孵育，滴加cyclin G1单克隆抗体、二抗及SP，室温孵育，DAB显色。Cyclin G1在细胞核出现棕黄色颗粒着色为阳性表达。 2、Western Blot检测cyclin G1在骨软骨瘤和骨肉瘤组织中的表达。 取新鲜样品加入裂解缓冲液，剪碎、匀浆、超声处理，高速低温离心提取上清蛋白，电泳、转印，经封闭后加相应的一抗、二抗及显色试剂检测。 3、RT-PCR检测cyclin G1 mRNA在骨软骨瘤和骨肉瘤组织中的表达。 Trizol提取RNA，逆转录合成cDNA后，以β-actin为内对照，进行PCR扩增。引物由上海生工生物工程有限公司合成。引物序列如下:cyclin G1:F5-AATGGCCTTAGAATGACTGC-3R5-ATGCCAACACAGATGGCTTT-3487bp;β-actin: F5-AGAGCTACGAGCTGCCTGAC-3R5-AGTACTTGCGCTCAGGAGGA-3300bp。PCR反应条件为:94℃变性5分钟，以94℃30秒、59℃30秒、72℃45秒循环35次，72℃延伸10分钟。 4、将针对cyclin G1 mRNA5端编码区起始密码子的ASON通过脂质体导入OS-732细胞共同培养后，用Western Blot和RT-PCR分别检测不同组间cyclinG1蛋白及mRNA的表达， MTT、流式细胞仪及电镜等方法检测细胞凋亡。 结果： 1、免疫组化结果:在34例骨肉瘤中，26例表达cyclin G1，阳性表达率76.47％;15例骨软骨瘤中1例cyclin G1阳性表达。cyclin G1阳性表达与肿瘤分化及是否转移复发有关(p＜0.01)。cyclin G1在中、低分化骨肉瘤中阳性表达率较高，而在高分化骨肉瘤中阳性表达率较低(92.31％、25％);在转移复发的骨肉瘤中表达率较高(100％)。 2、Western Blot和RT-PCR结果:骨肉瘤组织中cyclin G1蛋白和mRNA表达水平均明显高于骨软骨瘤。 3、cyclin G1反义脱氧寡核苷酸对OS-732细胞生长的抑制作用及细胞凋亡检测 (1)在倒置相差显微镜连续观察细胞形态，反义脱氧寡核苷酸用脂质体转染对OS-732细胞的生长有明显抑制作用，从第2天起ASON组的细胞数较SON组及空白对照组减少，第3天最为明显，并且ASON组的细胞数较其它组细胞生长较分散 (2) MTT法测定ASON组细胞抑制率的分析结果，第一天为(20.195±5.192)％，第二天为(40.660±2.474)％，第三天为(59.260±2.002)％，明显高于其他组细胞的生长抑制率(P＜0.01) (3)流式细胞仪检测:根据DNA含量直方图分析，经cyclin G1 ASON处理的OS-732细胞，其G0/G1期、S期、G2/M期细胞比率与对照组及SON组比较无明显差异(P＞0.05)，不能说明对细胞增殖有抑制作用。但ASON组的细胞凋亡率为(12.54±0.63)％，对照组和SON组的细胞凋亡率分别为(0.57±0.23)％，(0.71±0.16)％，它们之间有显著性差异(P＜0.01) (4)电镜:发现ASON作用于OS-732细胞后出现典型的凋亡改变:胞浆浓缩，细胞核固缩，染色质浓集成团，染色体边集成月牙状、块状或环状，核膜完整，胞浆浓缩并有空泡出现，有凋亡小体出现。 结论： 1、cyclin G1在骨肉瘤的发生、发展过程中可能起着重要作用。 2、ASON组中cyclin G1的蛋白及mRNA表达都较其它组显著减低，表明cyclin GⅠ蛋白表达增高的主要原因可能是转录增加。 3、cyclin G1 ASON体外转染OS-732后，降低了骨肉瘤细胞的增殖速度，并出现细胞凋亡。