研究背景近年来随着兽药、农药、激素和饲料添加剂等的广泛应用,我国畜牧业迅猛发展、畜产品数量高速增长,但同时也给畜产品的安全带来了巨大隐患。己烯雌酚(diethylstilbestrol, DES)是一种非甾体类雌激素,它是由人工进行合成的。它目前常用于家畜禽的增肉剂,鱼类生长促进剂等。该化合物在生物体内不易降解,通过食物链富集,并最终作用于人体。它在结构和功能上与内源性雌激素(如雌二醇)极其相似,可干扰机体的内分泌物质的正常功能,破坏机体内环境的稳定,进而影响机体的生殖系统发育,导致生殖障碍,甚至引发肿瘤。大量流行病学调查结果显示近年来男性精子数量减少、精子质量下降、睾丸癌和前列腺癌的发病率明显上升、男性女性化等可能与人们长期暴露于这些环境雌激素污染物中有一定关系。因此,环境雌激素对雄(男)性生殖系统的危害已成为目前研究的热点之一。本课题选取食品添加剂中常见的雌激素污染物——己烯雌酚作为研究对象。一方面,建立己烯雌酚对小鼠精母细胞(GC-2)的染毒模型,并对其损伤效应进行全面评价。另一方面,从DNA甲基化的角度入手,深入探讨己烯雌酚生殖毒性过程中发生DNA甲基化修饰异常的基因,并以该基因作为线索来进一步阐明己烯雌酚生殖毒性的分子生物学机制。第一章己烯雌酚对小鼠精母细胞染毒模型的建立及损伤效应评价目的：通过建立DES对GC-2细胞的体外染毒模型,观察细胞形态,检测活性氧、细胞周期、细胞增殖和细胞凋亡等细胞功能学指标,从而对己烯雌酚生殖毒性的损伤效应进行初步评价。方法：1.细胞活力检测：GC-2细胞分别用不同浓度DES (0-100μM)作用24h、48h和72h,使用细胞增殖—毒性检测试剂盒(CCK8)检测细胞活力。2.细胞形态观察：GC-2细胞分别用DMSO,0.2、2、20μM DES作用48h,在光学倒置显微镜(10×)下观察拍照。3.细胞周期检测：GC-2细胞分别用DMSO,0.2、2、20μM DES作用48h,使用细胞凋亡与细胞周期检测试剂盒处理各组细胞后,在流式细胞仪相应的程序下进行检测。4.细胞增殖检测：GC-2细胞分别用DMSO,0.2、2、20μM DES作用48h,使用EdU试剂盒处理各组细胞后,在荧光倒置显微镜UV和Green光激发下进行观察拍照。5.ROS检测：GC-2细胞分别用DMSO,0.2、2、20μM DES作用48h,使用细胞活性氧检测试剂盒处理各组细胞后,在流式细胞仪下检测细胞ROS变化情况。6细胞凋亡检测：GC-2细胞分别用DMSO,0.2、2、20μM DES作用48h,采用Hoechst33258染色后,在荧光倒置显微镜UV光激发下进行观察拍照；GC-2细胞分别用DMSO,0.2、2、20μM DES作用48h,采用Annexin V-FITC细胞凋亡检测试剂盒处理各组细胞后,在流式细胞仪相应的程序下测定GC-2的凋亡率；GC-2细胞分别用DMSO,0.2、2、20μM DES作用48h,采用WesternBlot检测凋亡蛋白(如：Bax、Bc12、Caspase3、Caspase9)的变化情况。结果：1.GC-2细胞随着DES作用时间和浓度的增加,其细胞活力逐渐下降,表现出一定的时间-剂量依赖性。2.与DMSO阴性对照组相比,随着DES浓度的增加,GC-2细胞形态发生多样性改变,细胞密度也明显减少。3.与DMSO阴性对照组相比,随着DES药物浓度的增加,S期细胞所占百分比明显增加(P＜0.01),G2/M期所占百分比明显减少(P＜0.01)。表明DES可阻滞GC-2于S期,抑制GC-2的增殖。4.与DMSO阴性对照组相比,随着DES药物浓度的增加,新生GC-2细胞所占比率明显减少(P<0.01)。表明DES能明显抑制GC-2细胞的新生。5.与DMSO阴性对照组相比,20μM DES的染毒组DCFH-DA的平均荧光强度明显增高(P<0.01)。表明DES能够诱导GC-2细胞内ROS含量升高。6.与DMSO阴性对照组相比,经Hoechst33258染色后,随着DES药物浓度的增加,GC-2细胞发生细胞核聚集,染色明显增强,并有细胞核碎片,可见凋亡小体。采用Annexin V/PI双染检测结果显示细胞凋亡比率明显增高(P<0.01)。采用Western Blot从蛋白水平检测发现凋亡蛋白也发生不同程度的改变。表明DES能够促进GC-2细胞发生凋亡。结论：己烯雌酚作用于小鼠精母细胞后,会引起其细胞形态学发生改变,ROS含量明显增高,使其阻滞于S期,增殖被抑制,凋亡发生,表明DES具有明显的生殖毒性。第二章DNA甲基化在己烯雌酚生殖毒性中的作用研究目的：利用.已建立的DES作用于GC-2细胞的染毒模型,探讨该染毒模型中是否存在DNA总甲基化水平及DNMTs表达水平的异常,并通过芯片结果筛选出DNA甲基化修饰异常的基因。方法：1.采用5-mC点杂交法对细胞染毒模型的DNA总甲基化水平进行检测。2.采用real-time PCR和Western Blot对细胞染毒模型的DNMTs mRNA和蛋白水平的表达进行检测。3.采用DNA甲基化芯片技术分别获得20μM DES染毒组和对照组的芯片结果,并对两组结果进行比较,筛选出染毒模型中存在DNA甲基化修饰异常的基因。4.采用MSP对存在DNA甲基化修饰异常的部分基因进行验证。5.对Rxra基因的MSP产物,测序,并进一步验证。6.采用real-time PCR对20μM DES染毒组和对照组中Rxra基因的mRNA表达水平进行检测。结果：1.与DMSO阴性对照组相比,随着DES浓度的增高,DNA总甲基化水平显著降低(P<0.01)。2.与DMSO阴性对照组相比,随着DES浓度的增高,DNMT1的mRNA水平的表达显著增高(P＜0.01), DNMT3a和DNMT3b的mRNA水平的表达显著降低(P<0.01)。与DMSO阴性对照组相比,随着DES浓度的增高,DNMT1和DNMT3b蛋白水平的表达显著降低(P＜0.01); DNMT3a蛋白水平的表达显著增高(P<0.01)。3.通过比较20μM DES染毒组和对照组的DNA甲基化谱,获得该染毒模型中DNA甲基化修饰异常的基因,其中甲基化程度上调3倍以上的基因有66个,甲基化程度下调3倍以上的基因有6个。上述差异基因与细胞的生长、分化、周期、凋亡和氧化应激等生物学过程有关。4.验证该染毒模型中DNA甲基化修饰异常的部分基因,结果显示相比于对照组,Rxra基因在20μM DES染毒模型组发生明显高甲基化,与基因芯片结果相一致。5.通过对Rxra基因的MSP产物进行测序,并对测序结果进行分析,结果显示相比于对照组,Rxra基因在20μM DES染毒组发生高甲基化。6.与对照组相比,20μM DES染毒组中Rxra基因的mRNA水平明显降低(P<0.01)。结论：在DES作用于GC-2细胞的染毒模型中,DNA总甲基化水平降低,DNMT1、 DNMT3a及DNMT3b的mRNA和蛋白水平也发生不同程度的改变,表明在该染毒模型中确实发生异常的DNA甲基化修饰。通过比较20μM DES染毒组和对照组的DNA甲基化谱,获得该染毒模型中DNA甲基化修饰异常的基因,验证发现相比于对照组,Rxra在20μM DES染毒组中发生高甲基化,同时nRNA水平低表达,这为后续进一步深入研究己烯雌酚生殖毒性提供了线索。