节肢动物的免疫防御完全依赖于先天性免疫,当病原物入侵时,它们只能依靠先天性免疫进行广谱性应答。先天性免疫是否发达是衡量节肢动物抗病能力强弱的决定性因素。黑色素形成沉积于入侵病原物表面是节肢动物进行免疫应答的重要表现,在免疫中发生黑化是节肢动物免疫应答唯一可以直接观察的标志。因此,从黑化免疫入手研究昆虫先天性免疫机制很早就受到人们的关注,尤其是在果蝇和蚊子等昆虫。家蚕是有重要经济价值的益虫,但易遭受多种病原体的侵袭,往往造成生产上的巨大损失。因此,研究揭示家蚕先天免疫机制对提高家蚕抗病能力和预防蚕病的发生具有重要的理论价值。同时,家蚕也是鳞翅目昆虫重要的分子模型,研究揭示家蚕先天免疫机制有利于推动鳞翅目其它昆虫的相关研究,为鳞翅目害虫的防治提供新的途径。目前,关于家蚕先天性免疫的研究报道主要集中在抗菌肽、模式识别蛋白以及信号通路等方面,而对于家蚕黑化免疫的报道却很少。本文从比较病黑蚕与正常蚕之间基因表达差异、体外黑化诱导、活体免疫诱导以及相关物质对细菌生长的影响等四个方面来探寻参与家蚕免疫黑化的基因等。主要研究结果如下：1.参与家蚕黑化免疫候选基因的筛选用荧光定量PCR (qPCR)分析正常熟蚕和同期病黑蚕之间黑色素代谢途径上基因的表达量差异,结果显示：BmYellow-f、BmTan、BmDat等3个基因的表达量在两种蚕体之间无显著性差异,BmPAH在病黑蚕中的表达量下调了8倍左右,BmTH、BmBlack、BmDDC、BmYellow、BmEbony等基因在病黑蚕中的表达量与正常熟蚕相比显著增加(P<0.001)。2.体液黑化免疫的体外实验用来自真菌(酵母菌)的甘露聚糖,来自革兰氏阳性菌的肽聚糖(PGN)和来自革兰氏阴性菌的脂多糖(LPS)等3种微生物细胞壁重要物质分子,在体外进行诱导家蚕体液的黑化免疫实验,结果显示：3种物质均能诱导家蚕体液发生黑化,其中脂多糖(LPS)比甘露聚糖和肽聚糖(PGN)诱导家蚕体液发生黑化的速度更快、程度更强。用在病黑蚕中明显上调表达的BmDDC基因对应的DDC蛋白酶的活性抑制剂(卡比多巴),对能强烈快速诱导家蚕体液发生黑化的脂多糖(LPS)进行黑化抑制实验,结果显示：卡比多巴能抑制脂多糖(LPS)诱导的家蚕体液黑化。这表明家蚕体液黑化免疫确实需要DDC活性。3.免疫诱导分析用大肠杆菌(革兰氏阴性菌)和枯草杆菌(革兰氏阳性菌)注射攻击家蚕,诱导家蚕免疫应答,用半定量RT-PCR分析攻击后家蚕血细胞中黑色素代谢相关基因BmPAH、BmTH、BmDDC、BmYellow、BmEbony、BmTan、BmDat和酚氧化酶基因BmPO1BmPO-1S, BmPO-2S的表达变化,结果显示：酚氧化酶基因BmPO1表达有下调趋势,BmPO-1S、BmPO-2S表达与入侵关系不明显；黑色素代谢相关基因BmTH、BmDDC、BmTan表达量有上调趋势,BmPAH、BmDat表达量有下调趋势,这与病黑蚕中表达情况大体一致；只有在革兰氏阴性菌入侵时能检测到BmYellow短暂的微量表达,所有样品中未能检测到BmEbony表达。4.抑菌分析在培养基中加入phe或tyr,大肠杆菌的生长与对照组无明显差异,培养基也没有明显变黑表现；在培养基中加入dopa或DA,大肠杆菌的菌落形成数明显比对照少,生长明显受到抑制,培养基也有明显变黑表现。这说明phe和tyr在空气中不能衍生成黑色素,没有或很少对大肠杆菌有杀灭作用,而dopa和DA在空气中能衍生成黑色素,对大肠杆菌具有明显的杀灭作用。综合各个实验结果,推测黑色素代谢相关基因中BmPAH、BmTH、BmDDC、 BmYellow、BmTan、BmDat等与家蚕免疫应答有关,家蚕免疫应答中形成的黑色素主要是DA黑色素,也有少量dopa黑色素,色素代谢中间产物phe、tyr、dopa、 DA和NBAD等可能与家蚕免疫应答有关。