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非酒精性脂肪性肝病(NAFLD)是除外酒精和其他明确的损肝因素所致的,以弥漫性肝细胞大泡性脂肪性变为主要特征的临床病理综合征,包括单纯性脂肪肝(SFL)、脂肪性肝炎(NASH)和肝硬化。最新统计学数据显示,中国成人NAFLD的患病率不断升高,呈低龄化发病趋势,并与肝硬化、肝癌的发生密切相关。目前NAFLD的一线方案是改变生活方式,但疗效并不理想。但中医药治疗NAFLD的疗效显著,并得到广泛应用。在前期工作中,我们根据NAFLD痰湿浊瘀,脾运失健的病机特点,选用大黄泽泻汤干预NAFLD动物模型,取得了显著疗效。但该方治疗NAFLD的具体机制尚不明确。我们希望通过本实验探讨大黄泽泻汤治疗NAFLD的机制,为中医药治疗NAFLD的研究提供思路和方法。目的:1.通过16sRNA测序、免疫组化、Western blotting等技术,观察大黄泽泻汤对高脂饮食诱导的NAFLD大鼠肠道菌群、肠粘膜机械屏障及肠道组织TLR4信号通路的影响;2.联合使用广谱抗生素建立伪无菌小鼠模型,通过16sRNA测序评估模型构建情况;3.运用粪菌移植(FMT)技术,移植各组大鼠粪便混悬液至伪无菌小鼠体内,通过16sRNA测序、免疫组化、Western blotting、透射电镜等实验手段,探讨大黄泽泻汤改善NAFLD肠粘膜机械屏障的可能机制。方法:1.采用45%高脂饲料喂养8周龄雄性SD大鼠16周,建立NAFLD大鼠模型,予大黄泽泻汤(5g/kg)干预NAFLD大鼠,观察各组大鼠一般情况、体重、肝功能及肝组织病理变化,运用高通f!量测序法检测各组大鼠粪便细菌16sRNA,运用免疫组化观测肠粘膜紧密连接蛋白ZO-1、Occludin的表达及分布,Western blotting法检测肠道组织中TLR4信号通路相关蛋白的表达;2.予8周龄SPF级C57BL/6雄性小鼠自由饮用含四种抗生素的无菌水(氨苄西林1g/L、硫酸新霉素Ig/L、甲硝唑1g/L、万古霉素500mg/L)4周,以建立伪无菌小鼠模型,观察各组小鼠的体重变化,运用高通量测序法检测各组小鼠粪便细菌16sRNA,评估造模效果;3.运用FMT技术,将正常大鼠、NAFLD大鼠及中药干预大鼠的粪混悬液以200ul/只进行灌胃移植,每周一次,共8周,观察各组小鼠的一般情况、体重、肝功能及肝组织病理变化,检测各组小鼠粪便细菌16sRNA,免疫组化观测肠道ZO-I、Occludin的表达分布,透射电镜观察小鼠肠粘膜超微结构,Western blotting法检测肠道TLR4信号通路相关蛋白的表达。结果:1。(1)大黄泽泻汤可有效降低NAFLD模型大鼠增加的体重,改善异常的功能及血脂水平,缓解高脂饮食导致的NAFLD大鼠肝脏脂质沉积及肝细胞损害;(2)大黄泽泻汤和高脂饮食均可导致Shannon指数、Chao指数较空白组下降,在不同细菌分类学水平上,大黄泽泻汤可显著下调NAFLD大鼠肠道菌群中升高的厚壁菌门(Firmicutes)、脱硫弧菌科(Desulfovibrionaceae)、脱硫弧菌属(Desulfovibrio)、埃希氏菌/志贺氏菌属(Escherichia/Shigella)细菌的比例,同时能上调拟杆菌门(Bacteroidetesother)、瘤胃菌科(Ruminococcaceae)、颤杆菌属(Oscillibac.ter)、Butyricicoccus 属细菌的比例;(3)大黄泽泻汤可上调NAFLD大鼠回肠、结肠组织中ZO-1、Occludin这两种紧密连接蛋白(TJ)的表达;(4)大黄泽泻汤可抑制NAFLD大鼠回肠、结肠组织中上调的TLR4信号通路相关蛋白。TLR4、MyD88、p-JNrK、p-ERK的表达,但对总JNK、ERK的表达无明显影响。2.(1)小鼠饮用含混合抗生素的无菌水4周后,其体重较正常SPF小鼠下降;(2)肠道细菌16S rRNA测序显示抗生素组小鼠粪便细菌Shannon指数与Chao指数远远低于正常SPF小鼠;(3)抗生素小鼠与正常SPF小鼠肠道细菌在各分类水平上有明显差异。3.(1)正常大鼠、NAFLD大鼠及中药干预大鼠的粪菌移植伪无菌小鼠后,各组小鼠在体重上没有差异;(2)予伪无菌移植小鼠中药干预大鼠粪便移植后,较移植NAFLD大鼠粪便的伪无菌小鼠表现出更低水平的肝功能及血脂指标,其水平与移植正常大鼠粪便的伪无菌小鼠相似;(3)三组粪菌移植小鼠在肝脏病理上无明显改变;(4)移植中药干预大鼠粪便的伪无菌小鼠较移植NAFLD大鼠粪便的,有更低比例的瘤胃菌科(Ruminococcaceae)、脱硫弧菌科(Desulfovibrionaceae)及脱硫弧菌属(Desulfovibrio)细菌,而拟杆菌属(Bacteroides)、颤杆菌属(Oscillibacter)、Butyricicoccus属细菌比例贝[则更高,较移植正常大鼠粪便的伪无菌小鼠相似;(5)移植中药干预大鼠粪便的伪无菌小鼠血较移植NAFLD大鼠粪便的,有更低的血FITC-dextran含量,更完整的肠粘膜超微结构,ZO-1、occludin表达分布也更近似正常小鼠;(6)移植中药干预大鼠粪便的伪无菌小鼠回肠组织TLR4、MyD88、p-JNK、p-ERK的表达,较较移植NAFLD大鼠粪便的更低。结论:大黄泽泻汤通过改善NAFLD大鼠肠道菌群结构,使致病菌比例下降,有益菌比例上调,减少肠道TLR4的配体LPS的产生,下调TLR4信号通路活性,从而改善肠粘膜机械屏障紧密连接蛋白的表达及分布,降低肠粘膜屏障通透性,减少致病菌及其代谢产物由肠道血流经门静脉入肝,达到改善肝脏炎症及脂质沉积的作用。