研究目的： 本课题是应用免疫组织化学染色技术，在蛋白质水平上研究hTERT基因在人胰腺癌组织中的表达及其与P-gp、Bcl-2、COX-2蛋白表达和临床病理特征的关系。利用RNAi技术靶向沉默胰腺癌细胞的hTERT基因表达，在基因水平上研究hTERT-siRNA对胰腺癌细胞的增殖、凋亡、细胞周期以及对P-gp、Bcl-2和COX-2基因表达的影响。 材料与方法： 材料 1.胰腺癌手术切除后存档的石蜡包埋标本38例，慢性胰腺炎标本25例，正常胰腺组织标本20例。 2.人胰腺腺癌Capan-2细胞株、SW1990细胞株。 方法 1.链菌素-生物素复合物免疫组织染色法：采用石蜡切片微波修复抗原染色程序检测hTERT、P-gP、COX-2、Bcl-2蛋白的表达，DAB显色。结果判断采用定性和半定量的方法。 2.胰腺癌的临床分期和组织分级标准：采用1997年国际抗癌协会制定的TNM临床分期标准，分为0，I，II，III，IV期。应用Kloppel组织分级标准：分1、2、3级。按手术记录描述肿瘤生长部位和大小。 3.Capan-2、SW1990细胞株应用RPMI1640培养基，置于含5％CO2，37℃的细胞培养箱中培养。 4.应用荧光标记的siRNA和Lipofectamine2000进行转染效率筛选实验。 5.应用细胞直接计数法和流式细胞术检测有效hTERT-siRNA序列对Capan-2细胞的增殖、凋亡和细胞周期的影响。 6.采用Trizol法进行总RNA提取。RIPA法进行总蛋白质的提取，BCA法进行蛋白质定量检测。 7.RT-PCR、RealtimePCR进行hTERT-siRNA有效序列的筛选和进行扩增检测hTERT、P-gP、COX-2、Bcl-2基因的mRNA表达水平，以β-Actin或GAPDH为内参照。 8.Westernblotting检测转染细胞中hTERT、P-gP、COX-2、Bcl-2蛋白表达水平，以β-Aetin为内参照。 9.统计学方法：计量资料采用均数±标准差表示，多组间均数比较采用方差分析，两组均数比较采用独立t检验：计数资料采用率或比表示，其比较采用t检验，频数的关联性应用Pearson列联系数rp表示。所有数据均在计算机SPSS10.0软件包上进行。 结果： 1.hTERT在人胰腺癌组织中的表达及其与P-gP、COX-2、Bcl-2蛋白表达和临床病理特征的关系 在38例胰腺癌组织中hTERT、P-gP、COX-2、Bcl-2阳性表达率分别为81.58％、52.63％、76.32％、57.90％，评分分别为6.04±1.08、4.50±1.75、5.96±1.60、5.61±1.08，而正常胰腺组织和慢性胰腺炎组织的hTERT与Bcl-2阳性率和评分均为0，在慢性胰腺炎P-gP、COX-2为低表达，阳性率分别为20.00％、24.00％，评分分别为1.21±0.86、3.59±1.42，在正常对照组阳性率分别15.00％、0，评分分别为0.90±0.58、0。胰腺癌组与其他组比较有统计学差异。 在胰腺癌组织中hTERT表达与P-gP、COX-2蛋白和Bcl-2蛋白表达分别有显著的正相关。 hTERT表达与肿瘤的部位、大小、分级无统计学差异，而与临床分期有显著性的正相关。 2.Lipo与siRNA最佳转染浓度筛选 应用Lipo转染试剂在同一优化条件下，Capan-2细胞可成功转染，平均转染效率>86％。但SW1990细胞用该试剂在同一条件下未转染成功。筛选siRNA的最佳浓度为50nm，Lipo最佳转染剂量为3μl/2ml转染体积中。 3.hTERT-siRNA沉默人胰腺癌Capan-2细胞hTERT基因的效率和最佳序列的筛选 siRNA001与siRNA002有很好沉默hTERT作用，以48h或72h小时为明显，沉默的效率为100％。与空白对照组相比，Capan-2细胞在转染后，其hTERT蛋白水平在转染48h和72h后被分别下调了94.34％和94.63％，而转染后24h抑制不明显，Lipo对照组和阴性对照组与空白对照组无明显差异。 4.hTERT-siRNA002沉默hTERT基因对人胰腺癌Capan-2细胞生长、细胞周期和凋亡的影响 hTERT-siRNA002的使用浓度为50nm，Lipo转染浓度为3μl/2ml转染体积，转染24h后，细胞生长已明显减慢，抑制细胞增殖率为26.39％，随着转染细胞按常规培养的时间延长，早期凋亡细胞明显增多，以24h后更明显；活性细胞明显减少，而损伤细胞明显增多，以6h后就明显；死亡细胞明显增多以24小时后更明显。siRNA组与阴性对照组和Lipo对照组均有明显差异。G0-G1期细胞明显增多，S期细胞明显减少，以24h后明显；G2-M期细胞明显减少，以48h后明显，晚期凋亡细胞增多，以48h后明显。 5.hTERT-siRNA002沉默hTERT基因对人胰腺癌Capan-2细胞的耐药、凋亡基因的影响 hTERT-siRNA002在上述沉默效应和同一沉默效率的基础上，同一措施处理细胞，COX-2、Bcl-2、P-gp基因mRNA表达的量在hTERT-siRNA002转染后48h均明显受到抑制，但在72h后均恢复至与对照组相似的水平，而阴性对照组与Lipo对照组的COX-2基因表达量呈上升趋势。 结论： 1.hTERT蛋白在人胰腺癌组织中呈高表达，阳性率为81.58％，而在慢性胰腺炎和正常组织中无表达。其表达与胰腺癌的临床分期有显著的正相关，而与肿瘤的部位、大小、分级无统计学差异。 2.在蛋白质表达水平上，hTERT与COX-2、P-gP、Bcl-2蛋白的表达均有显著的正相关性。 3.hTERT-siRNA001与002序列可完全沉默Capan-2细胞hTERT-mRNA的表达。 4.hTERT-siRNA可抑制人胰腺癌Capan-2细胞生长，使较多的细胞停留在G0-G1期，而进入G2-M期和S期的细胞减少，可促进细胞的早期凋亡与晚期凋亡。 5.hTERT-siRNA可短暂抑制人胰腺癌Capan-2细胞的COX-2、P-gP、Bcl-2基因的表达。