自然杀伤细胞(NK细胞)的发现是一次偶然的机遇，源于免疫学家对荷瘤小鼠肿瘤特异性细胞体外活性的研究。该研究以正常未免疫小鼠和非相关肿瘤抗原免疫小鼠作为阴性对照，在检测抗原特异性淋巴细胞对肿瘤特异抗原的免疫应答时，发现对照组也表现出对肿瘤细胞明显的杀伤效应。对照组的这种非特异性杀伤证实存在一种不同于T，B淋巴细胞的大颗粒淋巴细胞，因其具有天然杀伤活性而被命名为自然杀伤细胞，占外周血淋巴细胞的10％-15％。NK细胞主要表现为抗病毒、抗肿瘤效应。 虽然NK细胞是淋巴细胞的一种，但是它不表达抗原特异性的受体，是天然免疫系统中的重要一员。尽管NK细胞和T淋巴细胞在杀伤机制方面有相似之处，但前者在很多方面仍不同于后者。主要表现为：NK细胞不表达特异性的T细胞受体和CD3分子；NK细胞对靶细胞的识别不受MHC的限制；NK细胞不形成免疫记忆。 为了更深入地研究NK细胞的识别、增殖、分化和杀伤机制，免疫学家建立了NK细胞的体外培养体系。然而，分离纯化NK细胞的技术尚存在一定的困难。而NK细胞系的建立则为NK细胞基础研究提供了良好的工具。目前，已建立了六种NK细胞系(YT,NK-92,NKL，HANK-1，KHYG-1，NK-YS)，其中NK-92细胞系的引起科学家更多的关注。NK-92来源于一个非霍奇金淋巴瘤患者，表型为CD2+CD3-CD4-CD8-CD16-CD56bright，生长依赖于细胞因子IL-2。国外同行已经将NK-92用来研究NK细胞介导的细胞毒效应机制，并阐明p58和p70杀伤抑制性受体的特异性及CD94和NKG2A的关系。 NK细胞表面存在激活性受体和抑制性受体。多年来，NK细胞识别非我并区分自我的机制困惑了许多免疫学家。而两种NK细胞不同活性受体的确认使这一问题有了比较满意的解答。抑制性受体包括KIR家族和NKG2A，NKG2A是凝集素家族NKG2系列的典型的抑制性受体的代表，在人类，其配体为HLA-E分子；激活性受体包括NKp44,NKp30,NKp46和NKG2D，NKG2D大概是目前与和细胞窘迫反应(包括转化，感染和细胞压力等)相关的最具特征性的一种激活性受体。主要表达于活化的CD8+T细胞、NK细胞和γδT细胞等。在人类，其配体主要为MICA，MICB，ULBP-1，ULBP-2，ULBP-3和ULBP-4。至于NK细胞表面膜结合型受体诱导活化的机制仍不是非常清楚，有待进一步研究。 NKG2D作为一种重要的激活性受体，在某些情况下可逾越抑制性信号的抑制，直接激活NK细胞对靶细胞的杀伤。该研究为了进一步揭示激活性受体NKG2D的作用机制，探讨激活性受体与抑制性受体之间的相互作用关系，以NK-92和NK-92IL-15(IL-15基因修饰的NK-92，本室构建)作为研究对象，拟应用有限稀释法克隆培养，并应用流式细胞仪筛选NKG2D、NKG2A表达阳性细胞，拟从中筛选出三种细胞模型—NKG2A单表达、NKG2D单表达和NKG2A、NKG2D共表达细胞株，并应用抗体阻断实验研究NKG2D激活性受体介导的杀伤功能。 方法: (1)有限稀释法克隆培养。NK-92细胞、NK-92IL-15细胞以100ul/孔，按照每孔一个细胞的浓度加入96孔中，无需辅助细胞参与。 (2)RT-PCR和FACS检测NKG2D、NKG2A和NKG2D配体MICA的表达。 (3)利用荧光显微镜检测NK-92细胞、NK-92IL-15细胞表面NKG2D和NKG2A的表达水平。 (4)穿膜FACS和Western-blot检测细胞胞浆内NKG2D表达水平。 (5)MTT比色法检测NK-92和NK-92IL-15细胞对恶性黑素瘤细胞系M21的杀伤。 结果: 一、不同培养基、不同浓度IL-2和IL-15对NK-92亚克隆形成的影响(1)利用完全新鲜培养基和等体积新鲜培养基与细胞培养上清混合培养时，后者在不同浓度IL-2或IL-15刺激下，表现出比前者略高的克隆成活百分率，但二者无统计学意义；(2)IL-2和IL-15联合刺激的NK-92细胞系和IL-2单独刺激的NK-92IL-15细胞系的克隆成活率并无明显差别。大约在10天左右即可见圆亮、集群的克隆形成。 二、不同NK-92和NK-92IL-15亚克隆NKG2D、NKG2A的表达水平应用RT-PCR、Western-blot、穿膜FACS和膜表面FACS在mRNA、胞浆蛋白以及胞膜蛋白三个不同水平，检测NKG2D和NKG2A的水平。RT-PCR结果表明NKG2D和NKG2A无论在NK-92还是在NK-92IL-15都有明显的mRNA转录，二者转录强度并无明显区别；在两种细胞系中，应用Western-blot都不能检测到其蛋白水平的表达，而应用穿膜FACS和膜表面FACS，虽然在NK-92检测不到NKG2A、NKG2D的表达，但是在NK-92IL15却能检测到NKG2D的低表达，NKG2A则和在NK-92细胞中一样没有表达。 三、MICA在黑素瘤细胞系M21细胞的表达水平RT-PCR检测M21细胞内NKG2D配体MICA，ULBP-1，ULBP-2和ULBP-3的转录水平，其中MICA在这几种配体中表达强度最高。FACS检测M21细胞表面MICA分子呈低水平的表达。 四、NKG2D抗体阻断对NK-92和NK-92IL-15细胞杀伤活性的影响应用MTT比色法检测IL-15基因修饰的NK-92细胞(NK-92IL-15)和NK-92细胞对黑素瘤细胞系M21细胞的杀伤实验显示，NK-92IL-15表现出更高的杀伤效应。应用NKG2D抗体阻断NK-92IL-15细胞表面激活性受体NKG2D后，发现其杀伤效应有明显的降低，提示NKG2D的活化在NK细胞介导的杀伤过程中起一定作用。 结论:克隆得到了NKG2D-/NKG2D+的NK细胞株；证明单独IL-15或IL-2足以刺激NK-92亚克隆形成，无需饲养细胞的参与，简化了有限稀释法克隆培养NK-92细胞系的方法；初步证明：NKG2D激活性受体介导的活化效应是NK-92IL-15比NK-92对恶性黑素瘤有更高杀伤活性的机制之一。