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鸭瘟是一种急性、热性、高度接触性传染病,该病对鸭、鹅、天鹅等造成的高发病率和高死亡率特征使其严重危害水禽业发展。本研究工作目的在于明确鸭瘟病毒(DPV) gC基因介导对宿主细胞的吸附特性,以及构建鸭瘟病毒gC~-/TK~-双基因缺失病毒株。主要研究内容和结果如下：1.鸭瘟病毒gC介导的吸附感染宿主细胞特性研究通过比较实验室前期构建的重组鸭瘟病毒gC缺失株(DPV-△gC-EGFP)与亲本株(DPV-CHv)对鸭胚成纤维细胞(DEF)吸附能力的差异及细胞表面硫酸乙酰肝素(HS)在其中的作用,探讨鸭瘟病毒gC介导的吸附感染宿主细胞的特性。首先,建立基于EGFP基因定量PCR检测DPV-△gC-EGFP和基于gC基因定量PCR检测DPV-CHv病毒DNA拷贝数的方法,检测病毒在DEF不同吸附时间和吸附1h后不同增殖时间病毒DNA拷贝数的差异,分析gC基因对病毒吸附的影响。结果DPV-△gC-EGFP和DPV-CHv均随着时间的延长病毒吸附量增加且于90 min时病毒吸附含量达峰值而稳定,各时间点DPV-CHv吸附细胞的病毒量均高于DPV-△gC-EGFP,吸附90 min后两种病毒含量差异不显著,但吸附60 min时DPV-CHv病毒量极显著高于DPV-△gC-EGFP;吸附1 h后DPV-△gC-EGFP和DPV-CHv均随增殖时间的延长病毒含量增加,增殖74 h以内的各时间点病毒含量差异不显著,但增殖74 h时DPV-CHv的病毒含量显著高于DPV-△gC-EGFP,表明gC与DPV吸附有关且主要在病毒吸附前期发挥作用。然后,将DPV-△gC-EGFP和DPV-CHv的病毒与不同浓度的肝素(Heparin)于37℃作用1h再接种DEF细胞及将不同浓度的肝素酶37℃1 h处理DEF细胞后再将病毒接种DEF细胞,定量PCR检测DPV-△gC-EGFP和DPV-CHv吸附感染DEF细胞病毒DNA拷贝数的变化。结果无论是Heparin与病毒作用后还是肝素酶处理细胞后DPV-△gC-EGFP和DPV-CHv病毒吸附感染DEF细胞的病毒量均并无显著性差异,表明肝素抑制病毒结合细胞表面HS以及肝素酶降解细胞表面HS后均不影响gC缺失株和亲本株病毒对DEF细胞的吸附感染,即DPV不依赖于HS吸附到DEF细胞。同时利用肝素层析柱HiTrap Heparin HP对透析复性的原核表达DPV-gC重组蛋白进行亲和层析,并设置原核表达的DPV-gB重组蛋白作阳性对照、原核表达的DPV-gE重组蛋白作阴性对照,以SDS-PAGE以及western blot检测各重组蛋白与HS的特异性结合力。结果表明DPV-gB能特异性结合HS,而DPV-gC与DPV-gE不能特异性与HS结合。综上表明,DPVgC不是通过与细胞表面HS结合而介导病毒吸附,且gC影响病毒的吸附主要在前期发挥作用,对病毒后期吸附的总量并无影响。2.鸭瘟病毒gC~-/TK~-双基因缺失株构建及部分生长特性根据gC和TK基因是疱疹病毒复制非必需基因且与病毒毒力有关,在实验室前期构建的TK缺失的细菌人工染色体重组鸭瘟病毒DPV CHv-BAC-G的基础上,利用大肠杆菌细胞内Red重组技术构建DPV gC~-/TK~-双基因缺失株DPV CHv-BAC-G△gC及其gC回复突变株DPV CHv-BAC-G△gCR, PCR、RFLP和IFA鉴定结果表明,成功获得鸭瘟病毒gC-/TK双基因缺失株及其gC回复突变病毒株。测定DPV CHv-BAC-G△gC与DPVCHv-BAC-G△gCR的部分体外生长特性,将病毒感染DEF细胞,用0.5%甲基纤维素固定病毒蚀斑的大小和形状并用0.5%结晶紫染色,观察比较蚀斑大小,结果CHv-BAC-G和CHv-BAC-GAgCR感染宿主细胞DEF后形成的空斑大小接近、形态相似,但CHv-BAC-GAgC形成的空斑显著减小,表明gC可影响病毒空斑的大小。将等量病毒DNA拷贝数的CHv-BAC-G、CHv-BAC-G△gC和CHv-BAC-G△gCR分别接种到DEF细胞,定量PCR方法检测接种后0～120 h不同增殖时间细胞和上清中的病毒DNA拷贝数,绘制病毒的一步生长曲线,结果各病毒在细胞中DNA的拷贝数均随增殖时间的延长而增加且36h时达峰值,之后开始下降,各病毒相同时间点的病毒DNA拷贝数差异不显著；而上清中各病毒DNA拷贝数含量均随增殖的延长而持续增加且120 h时为最高值,各病毒相同时间点的病毒DNA含量差异不显著,表明DPV的gC~-/TK~-双基因缺失株和gC回复突变株在感染细胞中产生相同的增殖周期,且可能存在gC基因的缺失抑制病毒的释放。