肺动脉高压(pulmonary artery hypertension,PAH)是心血管常见疾病,其主要特征是肺动脉压力和肺血管阻力进行性升高,最终导致患者右心衰竭而死亡,其病因复杂,诊断治疗棘手是该领域长期发展缓慢的主要原因。众多的手段用于征服这种顽固的疾病,尽管静脉给予药物(如前列腺素12,内皮素受体拮抗剂)或者吸入NO显示可以暂时降低PAH,改善运动耐力和生活质量,这些效果还不能持久。因此,再生手段和基因治疗用于打断PAH的恶性循环,为再生健康的内皮细胞,移植骨髓细胞,如内皮祖细胞(EPCs)、内皮样祖细胞和间充质干细胞已见报道；转染肾上腺髓质素或eNOS增加损伤的肺动脉血管内皮的治疗效果,借以增加肺动脉血管床,并加强由内皮细胞分泌的NO,也在进行尝试。干细胞移植治疗肺动脉高压正处在热点研究中,对于采用不同移植途径、移植数量的安全性,以及不同细胞数量对PAH的效应、移植前后的内皮素-1 (endothelin-l,ET-1)变化等没有相关研究。ET-1是血管内皮细胞产生的21肽氨基酸,具有强大的促细胞分化增殖作用,是体内迄今为止所知的最强缩血管多肽。ET-1的活性显示并不具有调节正常肺血管腔的活性,但是,在疾病时其活化显示非常突出：ET-1可以参与血管重塑可以直接收缩肺血管,刺激肺血管平滑肌和成纤维细胞增生,又可促进血小板聚集,超氧化物产生,从而促进肺动脉高压发生、发展。因此血浆及组织ET-1既是促进肺动脉高压形成的机制之一,也是肺动脉高压严重性的标志。本研究的目的是建立大鼠骨髓间充质干细胞培养体系及野百合碱诱导的大鼠肺动脉高压模型,研究不同数目的MSCs静脉移植对MCT诱导大鼠的肺动脉高压的影响,通过检测RVSP、RV/LV+S重量比,肺组织切片肺小动脉病理变化以及肺组织前体ET-1mRNA及血清ET-1检测,判断MSCs对PAH的影响,并找出安全、适宜移植的细胞数目,为临床治疗肺动脉高压提供新的治疗方法并提供理论依据。Wistar大鼠骨髓间充质干细胞培养、鉴定和标记实验方法：采用全骨髓贴壁培养法分离培养Wistar大鼠的MSCs。采用相差显微镜观察MSC的形态学特征；流式细胞仪检测细胞表面标志抗原CD29,CD44,CD34和CD45的表达率；电镜观察MCS超微结构；碱性磷酸酶染色检测MSCs成骨分化。DAPI标记MSCs为下一步进行体内细胞移植示踪。结果：原代培养的MSCs于24h后贴壁,6～8d后形成集落,10～15d可达到80%～90%融合。第3代细胞表面标记物CD29,CD44,CD34和CD45的阳性率分别为98.6%,78.2%,0.0%和0.3%。用成骨细胞诱导培养液培养的第3代细胞14d后部分分化为成骨。DAPI可良好标记MSCs细胞核,呈蓝色荧光。两种剂量野百合碱(Monocrotaline,MCT)诱导建立大鼠肺动脉高压模型的病理变化实验方法：70只雄性Witar大鼠随机分为：对照组(n=10), 50mg·kg-1MCT组(n=30)、60mg·kg-1MCT组(n=30)。腹腔注射MCT(对照组注射等量生理盐水),在2wk及4wk后,检测右心室收缩压(RVSP)、RV/(LV+S)重量比值,肺组织苏木素—伊红染色和地衣红染色,观察肺的病理改变、肺小动脉中膜厚度百分比。10只50mg-kg-1MCT组及60mg-kg-1组诱导大鼠记录自然死亡天数。结果：大鼠经过MCT诱导后,50mg-kg-1组2wk和4wk时与对照组比较：RVSP增高(36.6±5.1mmHg,39.1±7.0mmHg versus 26.1±3.8mmHg, P<0.01); RV/(LV+VS)重量比(0.2894±0.0217,0.4094±0.1256 versus 0.2473±0.0193,P<0.01).60mg-kg-1组2wk和4wk时与对照组比较RVSP (36.8±5.5mmHg,46.6±12.6mmHg versus 26.1±3.8mmHg, P<0.01);RV/(LV+VS)重量比(0.3082±0.0584,0.4175±0.1037 versus 0.2473±0.0193,P<0.01),但两个剂量组之间在2wk和4wk时比较均无差异显著性。4wk时,50mg-kg-1和60mg·kg-1 MCT组肺小动脉中膜增厚,厚度百分比分别为(21.3±1.9)%和(23.4±2.3)%,与对照组比较(11.3±1.2)%,均具有显著性差异。60mg·kg-1 MCT组大鼠47d死亡50%,63d全部死亡,而50mg-kg-1诱导后47d未见死亡,63 d30%死亡骨髓间充质干细胞移植对大鼠肺动脉高压治疗作用及对ET-1表达的影响方法：培养Wistar大鼠(7d)骨髓间充质干细胞,取第3代细胞进行移植。实验动物采用正常健康雄性Wistar大鼠68只(180-250)g。(1)：大鼠20只,颈外静脉移植MSCs个数分为5×105组、1×106组、5×106组和对照(生理盐水)组,每组5只,测量细胞移植前、移植后5min,30min及24h的大鼠RVSP; (2):大鼠8只,60mg-kg-1 MCT诱导,按静脉内移植及气道移植分为2组,每组各4只,以DAPI标记的MSCs 1×106个细胞进行移植,移植后3wk取肺组织冰冻切片,观察肺组织标记的细胞；(3)：大鼠40只,随机分组：①MCT/MSCs 5×105组：②MCT/MSCs 1×106组；③MCT组：④ontrol组,每组10只,细胞移植前以腹腔注射60mg·kg-1MCT(对照组注射等量生理盐水)诱导,分别注射1mL PBS液体含MSCs 5×105个、1×106个以及单纯PBS液体。4 wk后检测大鼠右心室收缩压(RVSP)、RV/(LV+S)重量比值；肺组织苏木素—伊红染色、地衣红染色和平滑肌Actin免疫组织化学染色,观察肺部的病理改变、肺小动脉中膜厚度百分比；留取腹主动脉血液,分离血清,免疫ELISA法测定血清内皮素-1的表达；取新鲜肺组织,分离mRNA,采用RT-PCR法检测组织表达前体原内皮素-1 mRNA的水平进行比较。统计数据采用SPSS16.0软件,对各组进行单因素方差分析检验。结果：(1) 5×105个MSCs与生理盐水对照组进行大鼠静脉内移植是安全的,几乎不导致明显的RVSP的增加；注射1×106个MSCs移植到静脉5min后,RVSP从(22.3±4.4)mmHg到(35.8±5.6)mmHg,30min后RVSP增加达到(44.2±4.5)mmHg;24 h后,RVSP为下降为(27.8±3.6) mmHg,与生理盐水对照组相比,会有残存的压力增加；但在移植5×106个MSCs死亡率高,不宜进行移植；(2)当MSCs (DAPI染色)经颈外静脉移植时3wk后,可见到肺野具有明显的蓝色荧光标记的MSCs,数目较多,经气道移植死亡率高,在存活的病例中,肺野发现少量蓝色荧光标记的MSCs;(3)在4wk后,MCT/MSCs 1×106组RVSP (35.6±8.4)mmHg与MCT组(47.2±10.5)mmHg相比明显下降(P＜0.05),心室比0.3572±0.0923明显低于MCT组0.4454±0.0935(P＜0.05),而MCT/MSCs 5×105组RVSP为(42.5±11.3)mmHg,心室比0.4003±0.0725,与MCT组相比无明显下降(两者P>0.05)；(4)病理染色可见肺组织肺小动脉中MCT/MSCs 1×106组中膜厚度分布为(19.2±3.8)%,较MCT组(26.4±4.9)%明显变薄(P＜0.05)；而MCT/MSCs 5×105组(23.3±3.6)%较MCT组无显著差异(P＞0.05)(5)肺组织前体内皮素mRNA及血浆内皮素-1结果均显示对照组表达ET-1表达很少,MCT组表达明显增高,MCT/MSCs 5×105组表达ET-1与MCT组相比减少(P＜0.05),但无MCT/MSCs 1×106组减少明显(P＜0.05)。本课题研究发现,将培养大鼠骨髓间充质干细胞移植到野百合碱诱导的肺动脉高压大鼠模型中,通过颈外静脉移植1×106个MSCs和5×105个MSCs是安全的,但经颈外静脉移植5×106个MSCs以及气道内移植MSCs死亡率高,不宜进行移植。骨髓间充质干细胞可抑制野百合碱诱导的肺动脉高压大鼠的RVSP和RV/(LV+S),减轻肺小动脉炎症反应、中膜肥厚,并可以明显降低野百合碱诱导大鼠的肺组织ET-1的mRNA及血浆ET-1蛋白表达,延缓诱肺动脉高压的进展过程。从ET-1各水平的表达来说,细胞个数1×106静脉移植对肺高压的作用较5×105明显。本课题利用细胞形态学观察以及电子显微镜、流式细胞仪、荧光显微镜对MSCs进行鉴定、标记；采用RVSP检测、病理HE染色、地衣红染色等鉴定肺动脉高压大鼠模型；采用病理及免疫组织化学染色、ELISA和RT-PCR等实验技术,研究MSCs移植对MCT诱导的肺动脉高压的抑制作用,移植后肺组织小动脉病理改变减轻。MSCs移植后肺组织ET-1的核酸及血清ET-1的水平均降低,1×106个细胞进行静脉较5×105个细胞移植效果显著。因ET-1是肺动脉高压过程中的重要分子,既是PAH的严重性的标志,也是PAH的发生机制,我们可以从分子水平上评价PAH的MSCs治疗效果。