论文部分内容阅读
腹膜纤维化是腹膜透析(peritoneal dialysis, PD)的主要并发症，很大程度上影响着腹膜透析作为长期肾脏替代治疗的效果[1]，而腹膜间皮细胞(Human peritoneal mesothelial cells, HPMCs)发生的上皮-间充质转分化（Epithelial-to-mesenchymal transition, EMT）被认为是腹膜纤维化的最初反应，也是腹膜透析早期相关性损害的一个关键环节[2]。发生腹膜纤维化时，间皮细胞下出现肌成纤维细胞以及细胞外基质(ECM)的积聚[3]。腹膜的EMT和纤维化与其他器官和组织如肺、心、肾、胸膜有类似的病理改变[4-5]。在EMT的过程中，可发现上皮细胞标志分子逐渐下调并消失，而间皮细胞标志分子逐渐上调[6]。研究发现转录因子Snail, Zeb和HLH家族在E-cadherin以及参与EMT过程的基因转录下调过程中起着重要的作用[7]，但是目前研究发现的转录因子尚不能完全解释腹膜EMT的分子机制，还有待于进一步发现新的更重要的转录因子。有研究报道，血清反应因子（Serumresponse factor, SRF)在肿瘤进展过程中起着重要的作用，特别是在上皮性肿瘤EMT中呈现高表达并且有很高的活性[8]，但是SRF在腹膜间皮细胞的EMT过程中发挥着怎样的作用尚不清楚。本课题对此问题进行了一系列研究。【目的】1. SRF在原代以及高糖刺激永生化的腹膜间皮细胞发生EMT后的表达及其作用。2. SRF在腹膜透析动物模型中的表达及其作用。【方法】1.将腹膜透析液离心后进行HPMCs培养，观察不同透析时间（透龄）原代HPMCs细胞的形态学变化；应用免疫细胞荧光化学的方法检测上皮标志分子E-cadherinh、间质标志分子α-SMA、Snail以及SRF的表达和细胞定位情况。2.通过高糖刺激永生化的HPMCs，建立腹膜间皮细胞间充质转分化的细胞模型，观察细胞的形态学变化，并采用Western-blot方法和免疫细胞化学荧光的方法检测上皮标志分子E-cadherin和间质标志分子α-SMA、Snail的表达。3.应用Western blot方法和免疫细胞荧光化学的方法检测SRF在未发生转分化和已发生转分化的细胞中的表达差异和细胞定位，同时检测SRF的活性形式即磷酸化SRF的表达。4.将SRF特异性上调质粒和对照质粒（由Dr. Eric Olson, Department ofMolecular Biology, UT Southwestern Medical Center at Dallas, USA馈赠）转染腹膜间皮细胞，检测在SRF上调时上皮标志分子E-cadherin和间质标志分子α-SMA、Snail的表达。5.将SRF特异性下调病毒转染到高糖刺激发生了转分化的细胞中，分别采用Western blot方法和免疫细胞荧光化学的方法检测在SRF下调时上皮标志分子E-cadherin和间质标志分子α-SMA、Snail的表达。6. SD大鼠腹腔内注射高糖透析液，建立高糖诱导大鼠腹膜纤维化模型，HE染色检测大鼠腹膜的厚度；采用免疫组织化学的方法检测上皮标志分子E-cadherin和间质标志分子α-SMA、Snail的表达以及SRF的表达及细胞定位情况。7. SRF特异性的抑制剂（CCG-1423）溶入高糖透析液中进行大鼠腹腔灌注，HE染色检测大鼠腹膜的厚度；采用免疫组织化学的方法检测上皮标志分子E-cadherin、间质标志分子α-SMA、Snail以及SRF的表达。【结果】1．SRF在人腹膜透析液HPMCs原代细胞中高表达，以及在高糖刺激永生化HPMCs发生转分化后高表达收集40例PD患者无菌夜间留腹PD液标本，离心后进行HPMCs原代培养，随着透龄的延长，细胞由鹅卵石样逐渐转变为成纤维样；免疫细胞化学荧光显示SRF由胞膜、胞质表达逐渐定位至胞核，并且SRF的表达也显著增强，与上皮标志分子E-cadherin表达呈负相关，与间质标志α-SMA、Snail的表达呈正相关。利用60mmol/L高糖在不同时间（0d、1d、2d、4d、7d）刺激人腹膜间皮细胞，与对照组5.6mmol/L相比,应用Western-blot显示SRF蛋白水平明显增高，并且呈现时间依赖性，与上皮标志分子E-cadherin表达呈负相关，与间质标志分子α-SMA、Snail的表达呈正相关；免疫细胞化学荧光显示SRF的表达也是逐渐增强的，并且出现核转位现象。2．体外实验证实SRF可以促进人腹膜间皮细胞间充质转分化永生化的HPMCs转染SRF上调质粒和对照质粒后，与对照组相比，Western-blot显示SRF的蛋白水平增高，上皮标志分子E-cadherin表达下降，而间质标志分子α-SMA、Snail的表达明显升高，与SRF的表达呈正相关；免疫细胞荧光显示在上调SRF表达组，其上皮标志分子E-cadherin表达明显减弱，而间质标志分子α-SMA、Snail的表达明显增强；高糖刺激永生化的HPMCs72h使其发生转分化后，转染下调SRF的慢病毒和对照病毒，与对照组相比，Western-blot显示SRF的表达水平降低时，上皮标志分子E-cadherin表达升高，而间质标志分子α-SMA和Snail的表达明显减少；免疫细胞荧光显示在下调SRF组的HPMCs中，上皮标志分子E-cadherin表达明显增强，而间质标志分子α-SMA和Snail的表达明显减弱。3．动物体内试验证实SRF抑制剂可以减轻腹膜纤维化腹腔内灌注高糖透析液建立腹膜纤维化动物模型，与对照组（腹腔灌注生理盐水）相比，HE染色切片显示大鼠腹膜的厚度明显增厚，免疫组化显示SRF表达明显增加，主要位于细胞核表达，上皮标分子志E-cadherin表达明显减弱，而间质标志分子α-SMA、Snail的表达明显增强；在SRF抑制剂组（CCG-1423加入高糖透析液）中，与腹膜纤维化组相比，HE染色显示，腹膜的厚度明显变薄；免疫组化显示SRF的表达也显著减弱，而上皮标志E-cadherin表达明显增强，而间质标志α-SMA、Snail的表达明显减弱。【结论】本研究通过体内外实验证实转录因子SRF在已发生间充质转分化的HPMCs或腹膜纤维化时高表达，主要定位于细胞核中，并且与上皮标志分子E-cadherin的表达呈负相关，与间充质标志分子α-SMA和Snail的表达呈正相关，提示SRF可以促进人腹膜间皮细胞的间充质转分化。