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HIV-1 Thai-B亚型感染性克隆的构建及其在中和抗体检测和疫苗研究中的初步应用最新的分子流调结果显示,我国目前流行的主要毒株是Thai-B,CRF07_BC,CRF08_BC和CRF01_AE,其中CRF07_BC和CRF08_BC是中国特有的流行毒株,是由Thai-B亚型和C亚型重组而成,而且Thai-B亚型已经取代了欧美B亚型(prototype B)成为我国流行率最高的病毒亚型。为了研究病毒的重组机制,监测和分析新出现的流行毒株,感染性克隆无疑是一个相当有力的工具。更为重要的是,迄今为止,尚无HIV-1 Thai-B亚型的感染性克隆问世。在成功获得了一株HIV-1 Thai-B亚型感染性克隆的基础上,我们建立了可置换gp120区域的嵌合假病毒,设计了针对我国主要HIV流行毒株的DNA疫苗并对其免疫原性和保护性作了初步的探讨。第一部分HIV-1 Thai-B感染性克隆的构建及其生物学活性的鉴定在将CNHN24的全长基因组分为两个半分子进行扩增后,我们利用低拷贝质粒pLG338为载体成功构建了HIV-1 Thai-B亚型的感染性克隆,该克隆转染293T细胞后,利用Western Blotting从细胞的裂解液中可以检测到病毒主要的结构蛋白,利用p24试剂盒可以在上清中检测到产生的衍生病毒,衍生病毒可以感染人外周血单核细胞和体外传代淋巴细胞并在其上复制,该衍生病毒可引起MT2合胞体病变,提示为SI毒株,辅助受体利用实验证明该衍生病毒为CXCR4嗜性。测序结果显示该全基因组无基因重排,插入和大片段缺失现象,该感染性克隆的gp120序列与其亲本原代分离株相比,V1区域存在13个氨基酸的缩短并造成了3个N-连接的糖基化位点的丢失,提示V1区域的长度与糖基化程度和病毒逃逸体内中和抗体的攻击有关。该感染性克隆的成功构建将会成为我们研究HIV致病机理的有力工具。第二部分可置换gp120区域的假病毒中和系统的建立HIV假病毒是评价疫苗诱生中和抗体和研究膜区相关功能的重要工具,其构建原理主要是分别构建骨架质粒(缺失功能性膜区)和膜区质粒(可表达全长膜蛋白的质粒),二者共转染293T细胞后,即产生假病毒颗粒,由于假病毒的基因组有缺陷(膜区缺失),其只具备感染性而无法正常复制。我们以SF162全长膜区克隆为骨架,在SF162 gp120的前导序列(leader sequence)和剪切位点(cleavage site)分别引入酶切位点NheI和SphI(此二酶切位点在HIV膜区基因中较为罕见),利用酶切鉴定和Western blotting证实了改造后的膜区克隆可以正常表达病毒的膜蛋白。我们还利用改造后的假病毒膜区克隆构建了几株嵌合假病毒,并对产生的假病毒对中和抗体的抵抗能力进行了评价,同时发现膜蛋白前体gp160的切割效率与产生的假病毒的感染能力有关。该嵌合式假病毒载体的建立为评价中和抗体和研究膜区致病机理提供了有力的研究工具。第三部分针对我国主要流行毒株DNA疫苗的设计及其免疫原性的初步研究目前我国主要流行的HIV亚型为Thai-B、BC和AE三种亚型,为研制针对这三种亚型的DNA疫苗。我们先后构建了包含GX48(AE)、GX79(AE)、NX22(BC)、GS22(BC)、HN24(Thai-B)三种亚型gp120的DNA疫苗,经Western Blotting验证,DNA疫苗可以在转染后的293T细胞中正常的表达gp120蛋白并分泌到胞外。采用DNA prime和Protein boost策略对新西兰大白兔进行免疫后,发现DNA初免后,抗体的滴度和中和抗体的水平都十分低下,经Protein boost后,针对gp120蛋白的抗体滴度和中和抗体滴度都得到了显著增强,此种策略的免疫效果要优于单独使用DNA和蛋白质进行免疫。随后我们还利用中和实验对免疫后兔血清针对几种假病毒和实验室毒株的中和能力进行了评价,发现多价DNA免疫后的兔血清中和能力和中和谱的宽度要明显优于单价DNA疫苗,提示多亚型HIV gp120混合免疫是一种行之有效扩大保护范围的免疫策略。但本实验仅为预实验,相关的实验研究将会在此基础上进一步开展下去。