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糖尿病因为胰岛素分泌不足或胰岛素抵抗引起的以慢性高血糖为特征的终身代谢性疾病。长期高血糖严重危害病人的心、脑、肾、周围神经、眼睛、血管等。糖尿病人主要通过胰岛素的注射来控制病情,而胰岛素注射容易引起低血糖昏迷,危及患者的生命。胰岛移植作为替代疗法,能够实现胰岛素分泌根据血糖水平的生理性调控。一次胰岛移植一般需要两个供体,而胰腺供体器官的缺陷严重限制了该方法的临床应用。随着基因编辑技术的发展,能够有效去除免疫排斥基因和内源性病毒,使得用其它动物源性的供体作为器官来源成为可能。猪因为生理结构和器官大小与人相似,器官易获取成为首选动物。利用猪胰岛进行移植必须进行临床前大动物的研究并在非人灵长类体内控制血糖达到半年以上。为推动我国异种胰岛移植的发展,我们开展了猪到猴的异种胰岛移植临床前研究。包括分离猪的胰岛并进行功能评价和测定,建立糖尿病食蟹猴模型以及将猪胰岛移植到糖尿病小鼠和食蟹猴的实验。同时,为了减轻免疫排斥反应,利用CRISPR/Cas9gRNA文库筛选了一系列的针对猪抗原的免疫抑制相关基因。猪到猴的异种胰岛移植平台的建立,能够推动异种胰岛移植在中国的发展,而新的免疫抑制基因的发现,能够进一步减轻免疫排斥反应。异种胰岛移植的发展和应用将从根本上解决糖尿病人胰岛素分泌不足的现状,改善糖尿病人的生活现状和生活质量。 本文主要从以下几个部分展开论述: 第一部分 猪胰岛细胞的分离和活性鉴定 目的:分离得到高纯度的猪胰岛细胞,用于细胞移植,控制糖尿病猴的血糖水平。 方法:首先将新生猪用异氟烷或者氯胺酮进行麻醉,无菌摘取胰腺,剪刀剪碎后,胶原酶Ⅺ消化,过滤残渣后获得胰岛细胞团,37度培养5天后,测定胰岛细胞活力和进行胰岛素释放实验。 结果:分离的新生猪胰岛细胞活力达到90%以上,胰岛素释放指数平均达到2.5倍。 结论:分离的新生猪胰岛细胞结构和胰岛素释放功能完好,不能控制糖尿病裸鼠血糖的原因,可能是移植的有效胰岛数量不足或者移植过程中胰岛细胞功能损坏。 第二部分 糖尿病食蟹猴的诱导 目的:诱导糖尿病食蟹猴模型,用于猪胰岛细胞移植的疗效评估 方法:向食蟹猴的颈动脉和颈静脉分别置管,STZ(100mg/kg)从静脉进行灌注,诱导食蟹猴成糖尿病模型,诱导成型的糖尿病猴需要每天2次给予胰岛素治疗,防止并发症的发生。 结果:100mg/kg STZ诱导的糖尿病食蟹猴,诱导过程中,血糖水平出现明显的三相变化,诱导成型后C肽水平低于0.Sng/ml,口服葡萄糖耐受实验显示,葡萄糖不能刺激胰岛素和C肽的分泌,免疫组化显示胰岛β细胞已经被破坏,肝脏和肾脏没有明显的损伤。 结论:通过颈动脉和颈静脉置管手术后,通过静脉置管一次性给予100mg/kg STZ能够稳定的诱导食蟹猴成糖尿病。 第三部分 猪胰岛到糖尿病小鼠肾包膜的移植 目的:分离的新生猪胰岛细胞进行移植前的功能评估 方法:将分离的新生猪胰岛细胞培养7天后,以2000IEQ/小鼠移植到糖尿病裸鼠的肾包膜下,并连续检测血糖,检测血糖是否恢复正常 结果:新生猪胰岛细胞不能使糖尿病裸鼠血糖恢复到正常水平 结论:移植实验过程中可能破坏了新生猪胰岛细胞的功能,移植手术时间应尽量缩短,在处理好小鼠暴露肾脏之后再收集胰岛细胞到收集管道中,尽量减少胰岛脱离培养环境到时间。 第四部分 筛选新的免疫抑制基因用于异种移植的研究 目的:探索人源T细胞中主要针对猪异种抗原的免疫抑制基因,抑制免疫排斥反应 方法:将CRISPR/Cas9gRNA文库转入到人T细胞系Jurkat,通过用PIEC和HUVEC与构建的细胞文库共培养两周,获得PIEC特异性抗原刺激后,人源免疫细胞增殖抑制相关的基因。 结果:转入文库基因之后,通过对照组表达谱的检测和分析,发现T细胞内敲除DNA结合相关蛋白;伴侣蛋白;IL-13,IL-5调节蛋白;蛋白折叠相关蛋白;锌指蛋白;胞质蛋白;乙酰化蛋白;敲除结构域含离子结合位点;Thr-rich区能够促进T细胞到增殖。T细胞内敲除ATP-结合蛋白;激酶;磷酸化蛋白;膜蛋白;核酸结合蛋白;G-蛋白偶联受体;敲除结构域含ATP结合位点;激酶结构域;Pro-rich区能够抑制T细胞的增殖。 结论:通过测序和生物信息学分析,得到了相应能够受猪特异性抗原刺激之后影响T细胞增殖和抑制相关的基因,需要进行单一基因的敲除和过表达来验证得到的实验结果。