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琯溪蜜柚[Citrus grandis (L.) Osbeck cv. Guanxi-miyou]属亚热带常绿乔木果树,是我国最主要的栽培柚类品种。汁胞粒化是柚类,也是柑橘类普遍发生的一种生理病害,严重影响琯溪蜜柚的食用品质和商品价值。因此,汁胞粒化原因的研究成为琯溪蜜柚生产的关键问题。本文通过对琯溪蜜柚果实成熟过程中汁胞粒化与活性氧代谢、细胞结构、矿物质、内源激素关系的研究,琯溪蜜柚汁胞mRNA差异显示实验体系的建立和差异片段的获得,采用RACE技术,克隆汁胞发育(正常发育与粒化)相关基因的cDNA全长,探讨了琯溪蜜柚果实汁胞粒化过程中的生理生化变化,并为从分子水平上阐明琯溪蜜柚汁胞粒化的机制奠定基础。取得的主要研究结果如下。1、以易发生汁胞粒化的老龄树和不易发生汁胞粒化的适龄树的琯溪蜜柚果实为材料,探讨琯溪蜜柚果实成熟过程中汁胞粒化与活性氧代谢的关系。研究果实成熟过程中汁胞MDA、H2O2、木质素含量,活性氧清除酶(POD、SOD、CAT)活性和内源抗氧化物质(AsA、GSH)含量的变化。与不易发生粒化的适龄树果实相比,易发生汁胞粒化的老龄树果实汁胞成熟过程中,汁胞粒化指数,H2O2、MDA和木质素含量增加,AsA和GSH含量减少,SOD活性前期减少后期增加,CAT活性增加,POD活性显著增加。琯溪蜜柚果实成熟过程中,活性氧代谢失调导致活性氧(H2O2)积累和POD活性的增强而促进木质素的合成,从而导致汁胞粒化的发生。2、通过石蜡切片对琯溪蜜柚果实(10月8日)粒化和未粒化汁胞的观测表明,粒化汁胞汁囊痈肿、囊壁角质增生、细胞层增加、细胞壁增厚,细胞壁的次生内镶物和复饰物的木质化程度增加,出现汁胞粒化现象。3、以易发生汁胞粒化的老龄树和不易发生汁胞粒化的适龄树的琯溪蜜柚果实为材料,探讨琯溪蜜柚果实成熟过程中汁胞矿质元素的变化。在琯溪蜜柚汁胞粒化过程中,N、K含量维持较高水平;与未粒化汁胞相比,粒化汁胞N、P、Zn、Mg、Ni、Cu含量较高,而Ca含量较低。4、以易发生汁胞粒化的老龄树和不易发生汁胞粒化的适龄树的琯溪蜜柚果实为材料,探讨琯溪蜜柚果实成熟过程中汁胞内源激素的变化。琯溪蜜柚由于自花不亲和,其自然单性结实果实为无核果实,在果实粒化过程中内源激素的不均衡分布,尤其是在粒化起动和加快阶段果实汁胞中IAA、GA3、ZR浓度偏低和ABA浓度偏高,以及GA3、ZR和ABA各自之间比例的改变引起的内源激素失衡是导致粒化的原因之一。5、以琯溪蜜柚老龄树(母树)不同粒化阶段果实的未粒化和粒化汁胞为材料,建立mRNA差别显示技术体系,包括汁胞总RNA提取方法、DDRT-PCR体系的优化。应用改良CTAB法提取琯溪蜜柚汁胞的RNA,获得的RNA质量高。筛选了DDRT-PCR体系中各反应因素的浓度,优化后20μL体系各组分浓度为:cDNA第一链产物2μL(RT反应体系中总RNA的用量为2μg)、dNTPmix浓度为40μM、单引物浓度为0.4μmol·L-1和Taq DNA聚合酶用量为0.2 U。该反应体系的产物经电泳检测,可以获得数量适宜、条带清晰、重复性好的cDNA片段。6、用9条锚定引物与20条随机引物组成了引物对180个,对供试琯溪蜜柚未粒化汁胞和粒化汁胞进行了反转录PCR扩增,应用mRNA差异显示技术研究琯溪蜜柚汁胞粒化过程中未粒化和粒化汁胞基因的表达,获得了差异cDNA片段25个,回收cDNA差异片段并进行克隆、测序及同源性比较分析。得到与粒化有关基因差异表达的cDNA片段7个,与未粒化有关基因差异表达的cDNA片段9个。Miyou1、Miyou 2、Miyou 7、Miyou 8、Miyou 17等5个片段已在GenBank中登录,登录号分别为:FJ866625、FJ866626、FJ866629、FJ866627、FJ866628 ,抽取部分差异片段经反Northern杂交获得2条阳性片段。7、首次采用RACE技术,克隆琯溪蜜柚汁胞发育(未粒化与粒化)相关基因的cDNA全长,根据与粒化有关的Miyou22 cDNA片段设计引物,进行保守区和5’RACE的克隆,通过序列拼接得到了cDNA全长序列,登录号为FJ866630;序列分析表明得到的cDNA全长共1602 bp,其中,5’UTR为142 bp,3’UTR为204 bp, 3’UTR区域还含有典型的加尾信号AATAA和poly(A)尾;开放阅读框(ORF)共有1254个碱基组成,编码418个氨基酸。将序列经过BLAST比较,该序列与翻译延伸因子1-γ高度同源,其中,与烟草、水稻的翻译延伸因子1-γ的同源性分别是81.3%、79%。翻译延伸因子与蛋白质合成延伸有关。8、根据汁胞未粒化基因差异cDNA片段Miyou1设计引物,采用RACE技术克隆了该片段5’端全长序列,将获得的5’端cDNA与Miyou1差异片段拼接,拼接后得到Miyou1全长序列,其大小为1152 bp,包含1个819 bp的开放阅读框架,编码272个氨基酸。其中,5’UTR为77 bp,3’UTR为244 bp,3’UTR区域还含有poly(A)尾。登录号为FJ866624。进一步的Blast分析显示,该cDNA全长序列与20S蛋白质酶体的β亚基5高度同源。其中,与鹰嘴豆的20S蛋白质酶体的β亚基5同源性较高,为84.9%,与水稻、小麦的同源性分别为76.1%和74.6%。20S蛋白质酶体与蛋白质的降解有关。