论文部分内容阅读
绿脓杆菌（Pseudomonas aeruginosa）是临床常见的条件性致病菌,当人体皮肤屏障功能受损及正常免疫功能低下时,多种组织器官易受绿脓杆菌感染,且此菌具有耐药性强和致死率高的特点。双组分调节系统（Two-component regulatory system,TCS）是原核生物占主导的信号传导系统,在细菌适应环境、发挥毒力等过程中行使重要的调控作用。然而,在皮肤感染过程中绿脓杆菌的双组分调节系统行使怎样的功能,以及对于它们如何调节致病性相关基因的表达从而促进绿脓杆菌引起皮肤感染的具体机制仍然知之甚少。本研究首先基于绿脓杆菌PA14的转座子突变文库的高通量测序（Tn-seq）技术,筛选绿脓杆菌皮肤伤口感染过程中致病性相关的双组分调节系统。实验发现在绿脓杆菌皮肤伤口感染的第1、3、5天内,共有684个基因可能与绿脓杆菌致病性相关,其中包含17个双组分调节系统基因。进一步选择影响最为显著的双组分调节系统PA 1432570/PA 1432580来研究其在绿脓杆菌皮肤伤口感染过程中的重要作用,将其命名为NioS/NioR。为了研究NioS/NioR在皮肤伤口感染过程中具体的功能机制,实验首先构建完成NioS/NioR基因敲除和回补菌株。通过小鼠伤口感染实验发现,NioS/NioR基因敲除菌株的感染能力明显下降,验证了 Tn-seq的结果,也确证NioS/NioR在绿脓杆菌皮肤感染中起着重要作用。为了研究双组分调节系统NioS/NioR是如何增强绿脓杆菌感染能力的,实验检测了绿脓杆菌生物膜这一衡量绿脓杆菌感染能力的重要指标,结果证明NioS/NioR可以调节绿脓杆菌生物膜的形成。进一步研究表明,NioS/NioR调控绿脓杆菌鞭毛介导的快速黏附于固相表面的能力,这是其生物膜形成的第一步。同时,通过测定其鞭毛依赖的群集运动能力,也佐证了NioS/NioR系统对绿脓杆菌鞭毛的影响。另一方面,巨噬细胞作为主要的先天免疫细胞,在机体识别并清除病原菌的过程中发挥巨大作用。研究发现NioS/NioR可以增强绿脓杆菌抵抗宿主巨噬细胞吞噬作用的能力,从而有助于其皮肤感染。进一步的实验数据表明,绿脓杆菌的抗吞噬能力得益于其通过NioS/NioR调节包括fliC、algD在内的多种抗吞噬相关基因的表达,也与NioS/NioR调控的生物膜形成相关。为了更全面深入地研究NioS/NioR系统是通过调节下游哪些毒性因子基因的表达,从而达到促进绿脓杆菌皮肤感染的目的,我们对NioS/NioR各基因敲除菌株和野生型菌株进行RNA-seq分析。数据表明,NioS/NioR调节包括绿脓杆菌反硝化作用、绿脓杆菌鳌铁蛋白的生物合成以及包括蛋白酶的表达等在内的57个毒力因子的表达。进一步实验证明NioS/NioR通过调节绿脓杆菌一氧化氮还原酶相关基因norB、norC等的表达,促进细菌降解巨噬细胞产生的一氧化氮,从而抵抗巨噬细胞的杀伤。综上所述,本研究通过Tn-seq技术筛选出绿脓杆菌致病性相关的新型双组分调节系统NioS/NioR,并证明NioS/NioR在皮肤感染过程中具有重要作用。一方面,NioS/NioR影响绿脓杆菌生物膜的形成,从而影响细菌致病性;另一方面,NioS/NioR增强绿脓杆菌抵抗巨噬细胞的吞噬作用来逃逸宿主的清除;第三方面,NioS/NioR促进绿脓杆菌降解巨噬细胞产生的一氧化氮,从而抵抗巨噬细胞的杀伤。此外NioS/NioR还通过调节绿脓杆菌鳌铁蛋白等其他多种毒性因子的表达来进一步增强绿脓杆菌的致病性。本课题的开展为系统了解绿脓杆菌引起皮肤感染的机制奠定初步的理论基础。