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研究背景:组蛋白甲基化是表观遗传学的重要研究领域,其可以通过改变DNA的三维构型调控基因转录。组蛋白甲基化修饰在前列腺癌发生、发展和复发中均起着重要作用。H3K27是组蛋白甲基化的重要位点,其甲基化修饰主要由EZH2(enhancer of zeste homolog 2)催化完成;甲基化的H3K27可以抑制多种基因的转录。KDM6B(lysine(K)-specific demethylase 6B)是一种组蛋白去甲基化转移酶,可以拮抗EZH2的功能,引起H3K27me3(H3K27 trimethylation)的去甲基化,进而促进多种基因的转录。既往研究发现KDM6B广泛地参与到细胞分化、增殖、沉默和凋亡等众多生命过程,进而在胚胎发育、肿瘤、炎症性疾病和神经退行性疾病等多种疾病过程中扮演重要角色。值得注意的是KDM6B可以被炎症因子、肿瘤因子和线粒体应激等多种因素诱导表达。既往研究报道,KDM6B在血液恶性肿瘤、胰腺癌、结肠癌、肾癌和胶质瘤等多种肿瘤中发挥着重要作用。但是,目前尚无研究系统地阐述KDM6B在前列腺癌中的表达特征、生物学功能和分子机制。研究目的:本课题的主要研究目的在于分析KDM6B在前列腺癌中的表达特征,探索其在前列腺癌预后判断中的价值;明确KDM6B在前列腺癌中的生物学功能,探讨其能否作为前列腺癌治疗的新靶点;探索KDM6B在前列腺癌中的上、下游调控机制。研究方法:本课题首先利用GEO(Gene Expression Omnibus)数据库和TCGA(The Cancer Genome Atlas)数据库中前列腺癌相关数据集,分析KDM6B mRNA在前列腺癌中的表达谱及在预后判断中的价值。进而应用自行构建的一套前列腺癌组织芯片,行KDM6B免疫组织化学染色;分析KDM6B蛋白在前列腺癌中的表达情况及对前列腺癌生化复发的预测价值。应用siRNA敲减KDM6B转录表达,在体外研究其对前列腺癌PC3和C4-2B细胞增殖、克隆形成、迁移侵袭、周期和凋亡的影响。在小鼠移植瘤模型中,采用In vivo-jetPEI混合KDM6B siRNA行瘤内注射,活体敲减KDM6B表达,明确KDM6B在体内对前列腺癌生长的影响。此外,探索KDM6B抑制剂GSK-J4在体外对前列腺癌PC3和C4-2B细胞克隆形成、周期和凋亡的影响,在小鼠移植瘤模型中对前列腺癌生长的影响。应用GEO数据库中前列腺癌相关数据集、“顶天立地”测序数据和组织芯片数据,分析了AR(androgen receptor)和KDM6B的相关性。对AR阳性的前列腺癌LNCaP细胞系予DHT(double hydrogen testosterone)和MDV3100(enzalutamide)处置,观察AR活性对KDM6B转录表达的影响。应用ChIP-PCR的方法明确DHT和MDV3100干预后,AR在KDM6B转录起始点上游结合情况的变化。运用基因芯片对比分析野生型C4-2B细胞和敲减KDM6B的C4-2B细胞的基因表达谱,筛选出发生差异表达的重要基因。进一步应用GEO数据库中前列腺癌相关数据集、“顶天立地”测序数据和组织芯片数据,分析了KDM6B和下游目标基因的相关性。在PC3细胞中敲减KDM6B表达或抑制KDM6B功能,观察对下游目标基因转录表达的影响。应用ChIP-qPCR的方法明确敲减KDM6B表达或抑制KDM6B功能后,下游目标基因转录起始点上游H3K27me3含量的变化。应用免疫沉淀和质谱分析相结合的方法,探索前列腺癌中与KDM6B相互作用的转录因子;并研究敲减KDM6B表达或抑制KDM6B功能后,目标转录因子与KDM6B的结合是否发生变化。进而应用ChIP-qPCR的方法明确敲减KDM6B表达或抑制KDM6B功能后,目标转录因子与KDM6B在下游目标基因转录起始点上游结合情况的变化。研究结果:通过分析前列腺癌测序数据和组织芯片数据,明确了KDM6B在前列腺癌中高表达,尤其是在转移前列腺癌和去势抵抗性前列腺癌中的表达更高。此外,KDM6B在高Gleason评分的前列腺癌患者中表达水平高于低Gleason评分的前列腺癌患者。高KDM6B表达的前列腺患者的无复发生存期显著低于KDM6B低表达的前列腺患者。体外功能实验发现,siRNA介导的KDM6B敲减可以显著抑制PC3和C4-2B细胞的增殖、克隆形成和迁移侵袭能力;将PC3和C4-2B细胞阻滞在G1期,降低S期和G2期细胞的比例;诱导PC3和C4-2B细胞发生凋亡。在小鼠移植瘤模型中,同对照组相比,敲减KDM6B表达可以抑制移植瘤的生长,两组之间的差异有统计学意义。KDM6B抑制剂GSK-J4可以显著抑制PC3和C4-2B细胞的克隆形成;将PC3和C4-2B细胞阻滞在G1期,降低S期和G2期细胞的比例;诱导PC3和C4-2B细胞发生凋亡。在小鼠移植瘤模型中,同对照组相比,GSK-J4可以抑制移植瘤的生长,两组之间的差异有统计学意义。通过分析前列腺癌测序数据和组织芯片数据,发现AR和KDM6B存在负相关。DHT处置可以抑制LNCaP细胞中KDM6B mRNA和蛋白表达,而MDV3100处置可以促进LNCaP细胞中KDM6B mRNA和蛋白表达。ChIP-qPCR实验表明,DHT处置可以在LNCaP细胞中增强AR在KDM6B转录起始点上游的结合进而抑制KDM6B转录,而MDV3100处置可以在LNCaP细胞中抑制AR在KDM6B转录起始点上游的结合进而促进KDM6B转录。AR在KDM6B的转录中发挥着负调控的作用。利用基因芯片分析野生型C4-2B细胞和敲减KDM6B的C4-2B细胞的基因表达谱,发现CCND1(cyclin D1)表达明显下降。进一步通过分析前列腺癌测序数据和组织芯片数据,发现CCND1和KDM6B存在正相关。在PC3细胞中敲减KDM6B表达或抑制KDM6B功能后,CCND1 mRNA和蛋白的表达下降。ChIP-qPCR实验表明,在PC3细胞中敲减KDM6B表达或抑制KDM6B功能后,CCND1转录起始点上游的H3K27me3含量上升。基于KDM6B的免疫沉淀和质谱分析,发现在前列腺癌中KDM6B与转录因子Smad2/3相结合。敲减KDM6B表达或抑制KDM6B功能后,PC3细胞中与KDM6B相结合的Smad2/3减少。ChIP-qPCR实验表明,在PC3细胞中敲减KDM6B表达或抑制KDM6B功能后,结合在CCND1转录起始点上游的KDM6B和Smad2/3减少。研究结论:KDM6B在前列腺癌中高表达,尤其在转移性前列腺癌和去势抵抗性前列腺癌中表达更高;KDM6B在高Gleason评分的患者中表达较高;KDM6B高表达可以作为前列腺癌早期复发的独立危险预测因子。体外和体内实验证实KDM6B可促进前列腺癌肿瘤细胞增殖和迁移侵袭能力,调控细胞周期和凋亡,发挥促癌作用。KDM6B抑制剂GSK-J4可以在体内和体外抑制前列腺癌细胞的增殖生长。机制实验表明AR负向调控KDM6B的表达,而KDM6B通过去甲基化CCND1转录起始点上游的H3K27me3,同转录因子Smad2/3相协作促进CCND1的表达。