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目的:青蒿烯（ATT）通过增加其稳定性和减少泛素化来激活核因子（红细胞衍生2-样2（Nrf2））。细胞质Nrf2阻遏剂Kelch样ech相关蛋白-1（Keap1）的半胱氨酸（cys）残基作为氧化还原传感器发挥作用,可能在激活Nrf2中起关键作用。确定ATT诱导的Nrf2活化是否依赖于Keap1的修饰,并阐明其潜在机制。方法:1.用Keap1功能缺失的细胞株,以tBHQ50 μM为阳性对照,不同浓度青蒿烯（0μM,1μM,4μM,7 μ M,10 μM）分别处理细胞16小时,裂解细胞收集蛋白用蛋白免疫印迹实验检测Nrf2水平。用MDA-MB231细胞株,敲除Keap1基因型,以MDA-MB231细胞野生型为阴性对照,5 μM青蒿烯处理细胞16小时后,裂解细胞收集蛋白用蛋白免疫印迹实验检测Nrf2和HO-1水平。2.首先在Cos-1细胞中过表达Keap1,不同浓度青蒿烯（0 μM,1 μM,4 μM,7 μM,10μ M）分别处理细胞16小时,裂解细胞收集蛋白用蛋白免疫印迹实验检测Keap1水平。然后,构建单位点突变Keap1载体,逐个位点突变Keap1中的半胱氨酸（-77、-151、-257、-273、-288和-297）后测序比对验证,扩大培养,提取质粒。最后获得6种不同的Keap1突变体质粒,每种质粒都有一个半胱氨酸（cys）（-77、-151、-257、-273、-288和-297）被丝氨酸（ser）替换,转染到细胞中。药物处理后裂解细胞作下一步检测。3.用青蒿烯处理表达野生型或cys151ser-keap1的细胞,加入环己酰亚胺（cycloheximide）,在不同时间点采集细胞进行免疫印迹,测定内源性Nrf2蛋白的半衰期。将 MDA-MB-231 细胞与 Keap1-C151S/Keap1、Nrf2 和血凝素泛素（hemagglutinin ubiquitin）共转染进行,随后进行ATT处理。收集细胞裂解液进行免疫共沉淀检测泛素化水平。4.青蒿烯处理转染野生型或突变型Keap1的细胞16小时后,裂解细胞收集上清用免疫印迹（western blot）检测Nrf2和HO-1的表达,用荧光素酶报告系统（Luciferase）检测Nrf2的转录活性。结果:1.以特丁基对苯二酚（tBHQ）为阳性对照,不同浓度青蒿烯处理Keap1功能缺失的A549细胞和敲除Keap1的MB231细胞,结果显示在A549细胞中Nrf2蛋白水平没有显著差异,青蒿烯处理的敲除Keap1的MB231细胞也未能增强Nrf2水平和下游基因的转录水平。青蒿烯激活Nrf2通路是Keap1依赖的。2.青蒿烯处理Cos-1细胞,浓度越高130kD灰度值越高,68kD灰度值则越少。分别定点突变Keap1上6个半胱氨酸位点,青蒿烯处理后检测,只有在转染半胱氨酸151的细胞中,除了 68kD的条带未发现130kD的条带。青蒿烯激活Nrf2通路具有浓度依赖性并且与Keap1 151半胱氨酸相关。3.野生型组不加ATT处理和转染Keap1-Cys151经过青蒿烯处理后组均未见延长Nrf2蛋白的半衰期。免疫共沉淀结果可见:野生型Keap1非药物处理组被泛素,而青蒿烯处理后野生型细胞未见泛素化Nrf2,同时可见青蒿烯对Keap1-C151S组蛋白裂解液中经或不经青蒿烯处理,Nrf2的泛素化状态没有影响。青蒿烯降低泛素稳定Nrf2依赖Keap1 151半胱氨酸。4.COS-1细胞与WT/C151s-Keap1、Nrf2、renilla和荧光素酶质粒共转染,并用ATT处理。与表达WT-Keap1的细胞相比,表达keap1-C151s的细胞显示出Nrf2依赖性转录活性降低,表明keap1-C151突变体失去了活化表型。青蒿烯是通过Keap1-Cys151激活Nrf2信号通路。结论:青蒿烯激活Nrf2通路是Keap1依赖的并且具有浓度依赖性。在Keap1中只有cys151ser突变体才能阻止ATT介导的Nrf2激活。这表明keap1的cys151残基可能与ATT相互作用,在Nrf2稳定和下游基因转录中起着重要作用。