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本文主要从以下几个部分展开论述: 第一部分 TRAF4在肝癌组织中的表达水平 目的: 分析TRAF4在根治性肝癌切除术后患者中肝癌组织及癌旁组织的表达情况,明确TRAF4用于肝癌特异性诊断及预后分子标志物的可行性,探讨TRAF4在肝癌中可能发挥的作用机制。 方法: 90例免疫组化(immunohistochemistry,IHC)肝癌样本来源于安徽省立医院普外科接受肝癌根治手术的90例HCC患者的标本,包括癌组织和癌旁组织(癌与癌旁组织之间距离约定为大于或等于1cm),手术时间为2006年8月至2009年11月,随访截止时间为2013年9月,随访期4~7年。入组肝癌病例中男78例,女12例,年龄24~91岁,平均年龄65岁,所有病例均病理确诊为肝细胞性肝癌,术前均未接受任何治疗。10例Western blot肝癌样本来自于2017年1月安徽省立医院普外科根治性肝癌切除术后的新鲜肝癌组织和其配对的癌旁组织。通过免疫组化染色和Western blot进行TRAF4蛋白表达量的检测。在免疫组化实验中,根据组织染色等级程度的不同而对标本进行分级。其中,阴性,0分,浅黄色,1分,黄色,2分,棕色,3分;同时根据肝癌细胞的染色阳性率来进行区分,则可表示为阳性率小于5%,0分;阳性率5%-25%之间,1分,阳性率25%-50%之间,2分,阳性率大于50%,3分。在染色样品中细胞染色阳性的评分=染色等级评分术阳性率等级评分,若这一数值超过4,则认为阳性标志物高表达;同时,若这一数值小于4,则认为阳性标志物不表达或者低表达,其中阳性组即为IHC大于4分的高表达组,阴性组为IHC评分小于4分的低表达组。TRAF4的表达由卡方检验及Kruskal-Wallis非参数检验进行分析。在Western blot实验中,对10例肝癌切除术后患者切片进行肝癌组织及癌旁组织的TRAF4蛋白光密度(optical density,OD)值进行比较,使用成组t检验进行数据分析,使用SPSS软件(13.0版本)对收集的数据进行分析。 结果: 1.TRAF4在肝癌组织中的表达可有两种,胞浆和胞核均可表达,主要定位于胞浆,其中肝癌组织染色呈阳性而癌旁组织则呈弱阳性或者未见明显染色,IHC评分显示其在肝癌组织中异常高表达,而癌旁组织中的IHC评分多小于4分,明显低于癌组织的IHC评分(t=7.330,p<0.005)。 2.TRAF4在肝癌组织中的阳性率为57.8%(52/90),而在癌旁组织中,TRAF4表达的阳性率仅为22.2%(20/90),两者存在显著性差异(p<0.001)。 3.TRAF4在肝癌组织中的OD值明显高于癌旁组织(1.03±0.07vs0.64±0.03,p<0.05),两者差异显著具有统计学意义。 结论: TRAF4可定位于细胞浆和细胞核,两者均有表达,以胞浆为主,在肝癌组织及癌旁组织中存在表达差异,且肝癌组织表达明显高于癌旁组织,提示TRAF4在肝癌中可能发挥了促癌作用。 第二部分 TRAF4对肝癌患者的生存分析与预后评估 目的: 研究TRAF4与肝癌患者的预后评价的相关性,明确TRAF4作为肝细胞癌特异性诊断及预后的分子标志物的可能性。通过分析TRAF4与无病生存时间(DFS)及总生存时间(OS),来判断TRAF4的表达对肝癌患者生存时间的影响,并通过COX回归分析,判断TRAF4是否能作为肝细胞癌患者独立预测预后的因子。 方法: 将肝癌组织中TRAF4蛋白的表达以IHC评分≥4分和<4分,分别定义为高表达组(阳性组)和低表达组(阴性组)。TRAF4高表达与肝癌的肿瘤大小(P=0.001)、肿瘤分期(P=0.006)相关,而与年龄、性别、分化、脉管侵犯无关。临床病理参数阳性率比较采用卡方检验。TRAF4高表达与低表达组之间的相关性采用Spearman等级相关分析,应用KaplanMeier生存分析法与log-rank检验分析TRAF4对肝癌患者生存时间的单因素影响;运用cox比例风险回归模型对肝癌患者多因素分析,明确TRAF4是否可作为肝癌发病的独立风险因素。 结果: 1.肝癌组织中TRAF4与临床病理特征的关系 TRAF4高表达与肝癌的肿瘤大小(P=0.001)、肿瘤分期(P=0.006)相关,而与年龄、性别、分化、脉管侵犯无关。 2.影响肝癌患者DFS和OS的分析 KaplanMeier分析表明,TRAF4蛋白高表达组DFS时间短于TRAF4蛋白低表达组(23.0vs.49.6个月,p=0.001)。同样的,TRAF4蛋白高表达组OS时间短于TRAF4低表达组(29.0vs.53.3个月,p<0.001)。单因素分析显示,除TRAF4外,肝癌大小及分期也与肝癌预后有关,而多因素分析则显示TRAF4高表达是肝癌不良预后的独立危险因素。 结论: 1.TRAF4高表达与肿瘤大小、分期有关,生存时间明显缩短,因此可作为肝癌预后评估分子标志物 2.TRAF4在肝癌患者明显高表达,同时也与不良预后独立相关,进一步TRAF4推测可能在肝癌发病及进展过程中发挥促癌作用 第三部分 TRAF4对肝癌患者血管生成的影响 目的: 在前期研究的基础上,我们进一步研究TRAF4与血管形成之间的关系,以期探索TRAF4在肝细胞癌患者中血管生成的作用及相关机制,为肝细胞癌抗血管生成治疗提供新靶点。 方法: 采用免疫组化的方法,对肝癌患者的组织切片进行VEGF和CD34的染色。在放大倍数为400X的显微镜下,选取5个主要的独立分开的视野,进行观察和筛选。通过镜下计数计算每个视野的阳性细胞数,并且进行算数平均值的计算。同时采用Westernblot法,对肝癌患者组织进行蛋白定量,比较不同组别之间VEGF蛋白表达量和CD34表达量的差别。 结果: 1.肝细胞癌患者的TRAF4与VEGF的表达呈正相关 在对组织切片进行VEGF的染色时发现,VEGF主要定位于细胞的细胞浆中。在组织切片的90名肝癌患者中,有56名患者的VEGF组织染色为阳性,阳性率达62.2%。有38位患者的组织切片中,既有TRAF4染色阳性,又有VEGF染色阳性,这部分患者所占的比率为42.2%。而只有20位患者的VEGF染色及TRAF4的染色均为阴性,这部分患者所占比率为22.2%。在用Spearman相关分析对TRAF4与VEGF进行分析时发现,肝细胞癌患者中TRAF4的表达与VEGF的过表达存在明显的相关性(r=0.262;p=0.013)。 2.TRAF4染色阳性的肝癌患者MVD高于TRAF4染色阴性的肝癌患者 通过免疫组化法对内皮细胞进行CD34染色,以评价MVD。同时,对CD34染色的检测也是为了进一步评价TRAF4表达情况与血管生成情况之间的关系。在肝细胞癌患者的组织切片中,MVD的数值从0/200至138/200之间不等(中位数为64/200,每个视野)。其中,在TRAF4阳性组与TRAF4阴性组的MVD比较可发现,TRAF4阳性组的MVD值明显高于TRAF4阴性组的MVD值(41.6±6.3vs.24.5±6.7,p<0.001)。 3.TRAF4染色阳性的肝癌患者癌组织及癌旁组织的VEGF和CD34表达量比较 通过Westernblot法对TRAF4染色阳性的肝癌患者癌组织及癌旁组织的VEGF和CD34进行比较。其中癌组织中VEGF的表达量高于癌旁组织(1.19±0.15vs0.65±0.04,p<0.05);在癌组织中CD34的表达量高于癌旁组织(0.79±0.06vs0.39±0.03,p<0.05)。 结论: 1.TRAF4与VEGF表达呈正相关 在肝细胞癌患者中,TRAF4与VEGF的表达呈正相关,VEGF为常见的促血管生成标志物之一,故TRAF4与其相关性表明,TRAF4可能参与了肝癌患者的血管形成机制。 2.TRAF4与MVD相关 TRAF4染色阳性组的肝癌患者MVD高于TRAF4染色阴性组的肝癌患者;TRAF4染色阳性的肝癌患者VEGF和CD34蛋白水平均较TRAF4染色阴性的肝癌患者高,间接证明TRAF4可能参与了肝癌新生血管的形成,且可能通过促进新生血管的形成从而影响了肝癌的发生、进展。 3.TRAF4染色阳性的肝癌患者癌组织及癌旁组织的VEGF和CD34表达量比较 在TRAF4染色阳性的肝癌患者中,癌组织的VEGF的表达量和CD34的表达量均高于癌旁组织,其与TRAF4在癌组织中的高表达呈正相关,进一步提示TRAF4在肝癌中可能发挥促癌作用。