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胎盘是妊娠过程中形成的一个独特且高度动态变化的临时器官,对孕产妇及胎儿的健康至关重要。DNA甲基化作为经典的表观遗传学调控方式,其在胎盘发育及滋养细胞合体化中的作用,以及这种调控异常是否参与子痫前期的发生,目前均不清楚。本研究综合利用人原代滋养细胞(Human primary trophoblast,PHT)、细胞系及临床样本,采用免疫组织化学、Western Blot、免疫荧光、生物信息学分析等技术,明确5-甲基胞嘧啶(5-methylcytosine,5mC)、DNA甲基转移酶(DNA methyltransferase,DNMT)1、3A、3B在人正常胎盘及子痫前期胎盘滋养细胞中的表达模式;阐明DNMT1、3A、3B在滋养细胞合体化过程中的作用;筛选合体化前后潜在受甲基化调控的差异表达基因;最后探明DNMTs与CREB信号通路的相互关系。获得的研究结果如下:一、滋养细胞中DNMTs的表达模式和甲基化水平利用人早孕绒毛组织、人绒毛合体滋养层重建模型、原代滋养细胞体外自发合体化模型及BeWo细胞系体外诱导合体化模型,通过免疫组织化学、免疫荧光、Western Blot等技术,研究DNMTs在滋养细胞中的表达模式,结果显示:DNMTs及5mC在早孕绒毛组织中均高表达于细胞滋养细胞层,少量表达于合体滋养细胞层,在新发合体滋养细胞层亦表达较低;在原代滋养细胞体外自发合体化及BeWo细胞系诱导合体化过程中均伴随DNMTs的降低表达。二、DNMTs在滋养细胞合体化过程中的作用采用细胞免疫荧光、Western Blot等技术,探究DNMTs差异表达对BeWo细胞系合体化的影响,结果显示:DNA甲基转移酶抑制剂5-aza抑制DNMTs的表达,BeWo细胞合体化增强;过表达DNMTs后BeWo细胞合体化受到阻碍。在原代滋养细胞体外自发合体化过程中利用cAMP/PKA/CREB信号通路抑制剂H89处理及BeWo细胞系5-aza诱导去甲基化模型中探究DNMTs与CREB信号通路的相互关系。Western Blot结果显示H89能够显著抑制原代滋养细胞体外自发合体化过程中CREB磷酸化及合体化标志物蛋白水平的表达,但因自发合体化引起的DNMTs的下调未能恢复;5-aza可诱导BeWo细胞系中DNMTs蛋白表达降低、磷酸化CREB蛋白表达升高。三、筛选合体化前后潜在受甲基化调控的差异表达基因基于原代滋养细胞体外自发合体化前后的甲基化芯片测序数据及GEO网上数据库,运用GO和KEGG聚类方法筛选出合体化前后去甲基化并且上调表达的差异基因,并利用荧光定量PCR、Western Blot、免疫组织化学等技术对差异基因验证。筛选出59个在合体化过程中去甲基化并且上调表达的目标基因,并进一步在BeWo细胞去甲基化模型中证实甲基化水平升高、转录组表达降低的调控模式,初步筛选出合体化过程中受甲基化调控的靶标因子Wnt7a。四、PE胎盘滋养细胞中DNMTs的表达模式和甲基化水平利用对照个体及PE足月胎盘组织以及分离的原代滋养细胞体外自发合体化模型,采用免疫组织化学、免疫荧光、Western Blot等技术,研究DNMTs在PE滋养细胞中的表达,结果显示:PE胎盘组织中合体滋养细胞减少,DNMTs及5mC表达水平均高于正常胎盘组织;PE胎盘原代滋养细胞体外自发合体化能力降低。综合以上结果,我们认为,在滋养细胞合体化过程中DNMTs下调表达,甲基化水平降低;DNA甲基化可能通过调控CREB信号通路磷酸化激活参与调控合体化过程;Wnt7a是在合体化过程中受甲基化调控的靶标因子;DNMTs异常表达影响PE胎盘中滋养细胞的合体化进程,可能与PE发生相关。