研究背景:冠状动脉粥样硬化性心脏病发病率高、预后差,是亟待解决的医学和公共卫生难题。然而,目前对其发病机制的认识仍然相当有限,需要探索新的生物学机制,进而发掘新的治疗靶点,这有助于降低大量未知的心血管风险^[1]。衰老是动脉粥样硬化性心血管疾病的主要危险因素,也影响着冠心病的发病和预后,抗衰老治疗对于延缓动脉粥样硬化具有重要的科学意义和临床价值。Klotho是体内的一种多效性蛋白,在组织和循环中均有表达,其水平随年龄增长而逐渐降低,并与肾功能负相关。组织表达的Klotho以膜受体形式存在,主要参与钙磷代谢的调节;循环中的Klotho作为一种激素样因子,则被认为具有抗氧化和抗衰老的生物学作用。Klotho敲除小鼠呈现出包括血管僵硬、血管钙化、动脉粥样硬化等血管衰老表型,而补充klotho可显著改善血管病变严重程度;表明Klotho是调控血管衰老的重要保护因素,因此可能参与动脉粥样硬化进程。细胞衰老包括复制性衰老和应激性衰老,且以增殖降低、形态改变、周期停滞和功能障碍为主要特征。自噬则是细胞应对应激的一种自稳机制,通过将自身成分进行降解以实现自我更新。衰老和自噬都是细胞应对应激损伤的一种适应机制,二者之间存在密切的联系。研究表明,敲除小鼠的自噬相关基因会导致个体发育畸形甚至死亡,衰老进程也伴随着自噬水平的降低,而恢复自噬则可延缓衰老的进展,这表明自噬有助于维持机体的稳态和健康。相关心血管研究也发现,激活自噬有助于减少应激对血管细胞的损伤,并对血管重塑和斑块稳定有重要的作用。在血管成分中,内皮细胞是生理功能的直接执行者,改善内皮衰老并恢复血管稳态或可成为抗粥样硬化的重要策略。因此,本研究拟探讨Klotho在代谢应激介导的内皮衰老中的作用;此外,鉴于自噬的重要生物学意义,本研究也将探讨Klotho、自噬与衰老的关系,以期深化对Klotho抗衰老机制的认识。炎症和代谢紊乱是动脉粥样硬化发病和进展的重要危险因素,二者之间也存在相互作用。一方面,代谢紊乱可上调系统性炎症,促进血管脂质沉积,激活以单核/巨噬细胞为表型的血管炎症,从而促进动脉粥样硬化;另一方面,炎症反应可介导胰岛素抵抗,从而加剧代谢紊乱程度并显著增加心血管疾病风险。慢性炎症和代谢紊乱也与衰老密切相关,然而这种相关性更多是基于对年龄的估计,目前仍然缺乏可以量化心血管风险的衰老标志物。因此,本研究也将探讨抗衰老蛋白Klotho与炎症代谢因素的相关性,并进一步评估Klotho与冠脉粥样硬化的关系。方法:第一部分:Klotho在代谢应激介导的内皮衰老中的作用及相关机制（1）培养人冠脉内皮细胞,用不同处理浓度（0μg/mL,25μg/mL,50μg/mL,75μg/mL）和不同处理时间（0 h,24 h,48 h,72 h）的Ox-LDL诱导内皮细胞衰老,并外源补充Klotho蛋白（400pM）进行干预;CCK-8检测细胞活力,SA-β-GAL染色检测衰老细胞数量,Western blot检测衰老相关蛋白P53和P16的表达,细胞免疫荧光反映P53和P16的胞内表达。（2）培养人冠脉内皮细胞,用不同处理浓度（0μg/mL,25μg/mL,50μg/mL,75μg/mL）和不同处理时间（0 h,24 h,48 h,72 h）的Ox-LDL诱导内皮细胞;Western blot检测自噬相关蛋白LC3和P62的表达。（3）在Ox-LDL（75μg/mL）处理下,分别给予Klotho（400pM）、雷帕霉素（5μM）和氯喹（2μM）干预;Western blot检测自噬相关蛋白LC3和P62的表达;腺病毒GFP-LC3转染内皮细胞,统计胞内绿色荧光亮点的数量。（4）在Ox-LDL（75μg/mL）暴露下,分别给予Klotho（400pM）、雷帕霉素（5μM）和氯喹（2μM）处理;CCK-8检测细胞活力,SA-β-GAL染色检测衰老细胞数量,Western blot检测衰老相关蛋白P53和P16的表达。第二部分:Klotho与炎症和代谢紊乱的相关性研究采用横断面研究的方法,连续纳入2017年12月至2018年3月于陆军军医大学第二附属医院心内科住院的308例心血管疾病患者。根据冠脉造影结果将受试者分为冠脉疾病组和非冠脉疾病组,收集所有患者的临床数据,并用ELISA检测患者血清的Klotho水平。各步骤如下:（1）比较冠脉疾病组和非冠脉疾病组的一般资料;（2）Spearman秩相关分析Klotho与炎症指标及糖脂代谢指标的相关性;（3）ROC曲线检验Klotho对脂质异常、糖代谢紊乱及代谢综合征的诊断预测效能;（4）logistic回归模型评估Klotho与代谢综合征的关系。第三部分:Klotho与冠脉粥样硬化严重程度的相关性研究沿用第一部分的分组和人群资料,收集所有患者的冠脉造影数据,并用ELISA检测患者血清的Klotho水平。各步骤如下:（1）显示冠脉疾病人群的冠脉病变资料;（2）ROC曲线检验Klotho对冠脉粥样硬化的诊断预测效能,Spearman秩相关分析冠脉疾病患者Klotho水平与SYNTAX评分的相关性;（3）比较冠脉复杂病变与非复杂病变的Klotho水平,ROC曲线检验Klotho对冠脉复杂病变的诊断预测效能;（4）logistic回归模型评估Klotho与冠脉严重病变的关系。结果:第一部分（1）Ox-LDL可诱导人冠脉内皮细胞衰老,且这种作用一定程度上呈现时间依赖性和剂量依赖性。（2）Klotho可减轻Ox-LDL对内皮细胞活力的抑制,减少衰老细胞比例,并抑制衰老相关蛋白P53和P16的表达。（3）Ox-LDL可抑制内皮细胞自噬,且这种作用一定程度上也呈现时间依赖性和剂量依赖性。（4）Klotho可以上调受Ox-LDL损害的内皮细胞自噬水平,并能减轻氯喹对自噬流的抑制。（5）Klotho可通过激活自噬减少Ox-LDL对内皮细胞活力的抑制,降低衰老细胞比例,并下调衰老相关蛋白P53和P16的表达。第二部分（1）冠脉疾病组较非冠脉疾病组年龄更大（P=0.003）、男性更多（P=0.013）、吸烟比例更高（P=0.001）;合并更高的炎症水平（P<0.001）、更差的肾功能（P=0.005）、更多的脂质异常（P<0.001）、糖代谢紊乱（P<0.001）和代谢综合征（P=0.026）;血清Klotho水平较非冠脉疾病组显著降低（P<0.001）。（2）Klotho与TG、HDL、FBG、HbA1c、TG/HDL-C比值、TyG指数等代谢指标显著负相关（P<0.001）;Klotho与MHR显著负相关（P<0.001）,MHR与CRP显著正相关（P<0.001）,代谢综合征人群具有更高的MHR和CRP水平（P<0.001）。（3）脂质异常、糖代谢紊乱及代谢综合征中的Klotho水平更低（P<0.001）,其ROC曲线下的AUC面积分别是0.731、0.728和0.713（P<0.001）。（4）多因素logistic回归显示Klotho独立与代谢综合征相关,高Klotho水平可能是代谢综合征的保护因素（OR=0.991,P<0.001）。第三部分（1）冠脉病变组的SYNTAX评分与Klotho存在负相关性（R=-0.527,P<0.001）;ROC曲线显示Klotho对冠脉病变具有良好的诊断预测效能（AUC=0.964,P<0.001）。（2）三支病变、钙化病变和SYNTAX≥23病变中的Klotho水平更低（P<0.001）;其ROC曲线下的AUC面积分别是0.794、0.796和0.803（P<0.001）。（3）多因素logistic回归显示Klotho独立与冠脉严重病变相关,可能是冠脉严重病变的保护性因素（OR=0.974,P<0.001）。结论1.Klotho的抗粥样硬化效应可能归因于抗内皮衰老作用;Klotho可以通过激活自噬改善代谢应激介导的内皮细胞衰老。2.Klotho水平与炎症及代谢紊乱显著相关;循环低Klotho可能是代谢综合征的独立危险因素。3.Klotho水平与冠脉粥样硬化显著相关;循环低Klotho可能是冠脉严重病变的独立危险因素。