妊娠滋养细胞疾病(GTD)包括葡萄胎、侵蚀性葡萄胎、绒毛膜癌等一系列与妊娠相关的疾病谱，目前为止确切的发病机制仍不清。从正常妊娠到葡萄胎，葡萄胎再恶变为侵蚀性葡萄胎，然后继续发展为绒癌的整个过程类似于一个上皮性肿瘤的癌变过程。具有大多数肿瘤无限增殖和转化及多阶段性发展的特征，并不是某一个或某几个基因异常所引起。 基因芯片技术是伴随着人类基因组计划实施而出现的新的基因分析技术。具有大规模和高通量的特点，是当前功能基因组学重要研究手段，它明显优于过去的单一基因研究模式，可以在整体的、基因组的水平对基因表达调控的网络机制，进行系统、全面地分析。 反义核酸技术是一种以应用反义核酸类药物来抑制特定基因表达为目的的基因治疗技术。反义核酸可以作为研究工具，用于对一些特定蛋白和基因的生理功能的研究。为我们特异性降调细胞内基因表达提供一重要方法。 为确定在GTD发病中的重要相关基因，我们首先利用DNA芯片技术，初步确定在葡萄胎和绒毛癌细胞中不同表达的基因；然后，利用传统的RT-PCR、免疫印迹、免疫组化方法，对基因芯片检测结果正确性和可靠性进行分析。最后，利用反义核苷酸技术，对肿瘤生物学行为有重要影响的基因进行绒癌细胞体外反义寡核苷酸干预实验，快速确定新的治疗靶向。 第一部分 葡萄胎和绒毛膜癌发病相关基因筛选 方法：用含4096条基因的表达谱芯片(cDNA基因芯片)，对2例完全性葡萄胎和2例正常绒毛及原代培养的早孕绒毛滋养细胞和绒癌JAR细胞株滋养细胞进行基因差异表达谱分析。 结果：葡萄胎2对临床标本中均有显著差异表达基因89条，占所检基因总数的2.2％。与正常绒毛相比，葡萄胎中24条基因表达显著增高(上调)，65条基因显著降低(下调)。JAR细胞与正常原代培养滋养细胞相比，432条基因下调，380条基因上调。葡萄胎和绒癌细胞中共同下调基因有46条，共同上调的有13条。抑制细胞生长的基因在葡萄胎和绒癌中下调，而与细胞增生、恶性转化、转移等浙江大学博士生毕业论文有关的基因上调。 第二部分芯片结果验证及滋养细胞增生机制探讨方法:利用传统的分子生物学研究手段免疫组织化学、免疫印迹及RT-PCR，对基因芯片证实葡萄胎和绒毛膜癌细胞中高表达的核昔酸还原酶小亚单位(RRMZ)、胸腺嚓陡核昔激酶一(TKI)、复制因子C小亚单位2(孙CZ)、CyelihBI基因，在巧例正常绒毛、20例新鲜葡萄胎组织、98例存档石蜡包埋滋养细胞疾病组织及JAR、JEG一3绒癌细胞中的表达情况进行较为详尽的检测。PCNA在98例存档石蜡包埋滋养细胞疾病组织的表达情况进行分析。结果:JAR、JEG一3细胞、葡萄胎组织RRMZ、TKlm丑NA和蛋白水平显著高于正常原代滋养细胞或正常绒毛组织，RFCZ在JAR、JEG一3细胞、葡萄胎中蛋白的表达显著高于正常绒毛和正常原代滋养细胞。Cyclin BI蛋白在JAR、JEG一3细胞、葡萄胎组织表达增加。 五项指标在石蜡包埋GTD组织中的表达显著高于正常绒毛，妊娠滋养细胞肿瘤未化疗者TKI、Cyclin Bl、PCNA表达显著高于葡萄胎，葡萄胎恶变者RRMZ、TKI、PCNA、cyclinBI表达显著高于自然恢复者，化疗影响TKI、RFCZ、Cyclin Bl表达，期别增加R侧MZ、TKI、RFCZ表达增强，wHO预后评分越高RRMZ、TKI、盯CZ、Cyelin BI表达越强，pCNA与Cyelin BI、TKI的表达呈显著正相关。第三部分RRMZ反义寡核昔酸对人绒毛膜癌细胞株体外生长影响t了方法:以脂质体(oligofectamjne)为载体，将人工合成的分别位于RR五江ZmRNA核昔酸序列626一645(编码区)和1572一1591(3’端非编码区)位点且全程硫代修饰的两条反义寡核营酸(antisense oligodeoxynucleotide，ASODN)片断导入绒毛膜癌JAR细胞中，用MTT法检测细胞成活率，免疫印迹和R下PCR方法检测ASODN对R侧MZ蛋白和mRNA表达的影响。结果:RRMZ编码区的ASODN(ASODNI)以量效和时效形式显著抑制JAR细胞增殖，以时效形式降调RRMZ的表达。3’端非编码区ASODN(ASODN2)对细胞增殖及RRMZ表达无明显的影响，但与ASODNI联合应用，对细胞的生长抑制作用和对RRMZ表达的影响显著加强。ASODNI作用12h，RRMZ表达水平开始下降;作用24h，细胞RRMZ表达和生长显著抑制，48h细胞生长和RR办滩2表达达最低水平，72h均又有所恢复。结论胰酶消化法是获得正常高纯度早孕绒毛滋养细胞的快速有效方法。表达谱基因芯片是一种快速、高效筛选滋养细胞疾病发病相关基因的方法。R侧MZ、TKI、盯cZ、PCNA、cycljllBI在GTD中存在过度表达。DNA合成酶TKI、RRMZ异常过度表达可能是导致GTD滋养细胞异常增生的因素。细胞周期蛋白Bl及复制因子C的高表达，说明GTD存在细胞周期检查点2内j浙江大学博士生毕业论文制。RR]MZ反义寡核昔酸通过特异性降调RRMZ蛋白和mRNA的表达，抑制绒毛膜癌JAR细胞的生长。联合应用针对RRMZ基因不同位点的ASODN是提高反义药物有效性的重要方法之一。联合应用基因芯片技术和反义寡核昔酸技术能够有效的筛选滋养细胞疾病发病相关基因，并快速确定治疗靶向