血瘀证可引发冠心病、心绞痛、脑卒中等多种心脑血管疾病,随着饮食结构的改变和人口老龄化,已成为威胁人类健康的重大疾病,应引起人们的广泛关注。近年来,中成药在心脑血管疾病防治中的应用越来越受到国际社会的关注与认可,其多成分、多途径、多靶点协同的作用特征,使得中药复方药效物质基础研究成为推动深层诠释中医药科学内涵与中医药理论现代创新的关键步骤。本研究结合血清药物化学、血清药理学、代谢组学、传统药动学-药效学模型的研究方法,采用液相色谱-质谱联用技术,以血流变学为药效学指标,进行了三七总皂苷配伍葛根总黄酮治疗“肾上腺素-冰浴法”致大鼠急性血癌证的药效物质基础研究。研究的主要内容与结果如下:以血流变学指标(200/s、30/s、1/s三个不同切变率下的全血黏度和血浆黏度)变化、心肌细胞损伤程度、血液粘滞状态持续性为依据,对目前常用的两种大鼠急性血瘀证模型复制方法一“高分子右旋糖酐法”和“肾上腺素-冰浴法”进行了比较,并选择“肾上腺素-冰浴法”复制本研究所需的急性血瘀证模型。采用基于ultra-HPLC-ESI-MS技术的代谢组学方法,研究了“肾上腺素-冰浴法”致大鼠急性血瘀证造模前后大鼠尿液代谢物谱的变化规律,在正、负两种离子模式下,共检测到24个生物标志物。利用正离子模式下发现的15个生物标志物的变化趋势,比较了血瘀证模型复制后的第1、2、3和5天的大鼠尿液代谢物谱的变化规律,确定模型的有效持续时间为3天,为进行药效学研究时,给药方案的合理制订提供了必要的依据。以葛根素注射液(54 mg/kg)为阳性对照,选择三七总皂苷13.5、27、54 mg/kg三个剂量与葛根总黄酮27、54、108 mg/kg三个剂量,分别经尾静脉连续给药7天后造模,以研究三七总皂苷与葛根总黄酮对大鼠急性血瘀证的干预作用。从200/s、30/s、1/s三个不同切变率下的全血黏度和血浆黏度的变化规律评价其药理活性,确定三七总皂苷和葛根总黄酮的有效剂量分别为27和54 mg/kg。采用基于ultra-HPLC-ESI-MS技术的代谢组学方法,研究了“肾上腺素-冰浴法”致大鼠急性血瘀证造模前后大鼠血浆和心脏组织代谢物谱的变化规律。在正离子模式下,检测到血浆中的12个和心脏组织中的16个生物标志物。通过上述生物标志物的变化,从系统水平评价了葛根素54 mg/kg、三七总皂苷27 mg/kg、葛根总黄酮54 mg/kg预防性给药一周后造模,急性血瘀证模型大鼠血浆和心脏组织在正离子模式下代谢物谱的变化规律,揭示了三七总皂苷与葛根总黄酮对大鼠急性血瘀证干预作用的机制。研究发现,三七总皂苷与葛根总黄酮对大鼠急性血瘀证干预作用的靶点与机理存在差异,并且除葛根素外,葛根总黄酮中尚存在其他可对抗大鼠急性血瘀证的活性成分。将三七总皂苷27 mg/kg和葛根总黄酮54 mg/kg进行配伍,对急性血瘀证模型大鼠治疗性给药一次,以氯化钠注射液为阴性对照,通过给药后1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0、5.0和6.0 h时血流变学指标的下降率,绘制三七总皂苷配伍葛根总黄酮对急性血瘀证模型大鼠治疗作用的药理效应-时间曲线;将急性血瘀证模型大鼠给药后2.0 h的含药血清提取物,对急性血淤证模型大鼠治疗性给药一次,以急性血瘀证模型大鼠空白血清提取物为阴性对照,通过给药后0.5、1.0、1.5、2.0、3.0和4.0 h时血流变学指标的下降率,绘制2.0 h含药血清提取物对急性血瘀证模型大鼠治疗作用的药理效应-时间曲线。二者进行比较后发现,药物进入机体发生疗效的过程存在一定的“时间滞后”效应。因此,在进行药效与血药浓度的拟合时,应将药效-时间曲线沿时间轴进行校正。基于ultra-HPLC-ESI-MS/MS技术,建立了大鼠血浆中3’-羟基葛根素、葛根素、3’-甲氧基葛根素、6”-O-木糖基葛根素、葛根素芹菜糖苷、大豆苷6个主要葛根异黄酮类成分浓度的分析方法,以芦丁为内标,血浆经含0.1%甲酸的甲醇沉淀蛋白处理后进样分析。该方法操作简便、灵敏度高、专属性强、分析时间短,符合生物样品的分析要求。将该方法应用于健康大鼠体内上述6个葛根异黄酮类成分的药代动力学研究后发现,葛根提取物经静脉注射给药后,6个主要异黄酮类成分的消除半衰期均小于1.5 h,于给药后8.0h在体内基本消除。基于HPLC-ESI-MS技术,以尿液与血浆为例,进行了葛根总黄酮在健康大鼠体内的代谢产物研究,推测出葛根主要异黄酮类成分9个代谢产物的结构,并发现其在尿液与血浆中具有很好的相关性。上述关于葛根6个主要异黄酮成分在大鼠体内过程的研究,可填补近年来除葛根素外,其他葛根异黄酮类成分在药代动力学研究与代谢产物研究方面的空白,为葛根异黄酮类成分后续研究的开展奠定基础。基于HPLC-ESI-MS技术,在正、负两种离子模式下,对本研究使用的血塞通注射液与葛根提取物中主要成分进行了分离鉴定,共检测到64个色谱峰。其中,皂苷类成分26个,黄酮类成分38个。采用正离子模式下的选择离子监测模式,结合葛根主要异黄酮成分在大鼠体内代谢产物的研究结果,对回注用急性血瘀证模型大鼠给药后2.0 h血清提取物中的药物相关成分进行了识别,共检测到63个色谱峰,其归属包括药物原型成分53个,代谢产物10个。从上述成分中选取44个色谱峰作为指标成分,采用正离子模式下的选择反应监测模式,建立了大鼠血浆中多指标成分的不加校正因子的内参比分析法,以黄芩苷和地高辛为内标,血浆经含0.1%甲酸的乙腈沉淀蛋白处理后进样分析。该方法操作简便、灵敏度高、专属性好、符合生物样品的分析要求。采用该方法于三七总皂苷27 mg/kg配伍葛根总黄酮54 mg/kg经尾静脉给药后1.0 h、1.5 h、2.0 h、2.5 h、3.0 h、3.5 h、4.0 h、5.0 h和6.0 h九个不同时间点,对急性血瘀证大鼠血浆中上述44个色谱峰以不加校正因子的内参比分析法进行了分析,为药效与血药浓度的拟合提供了准确可靠的血药浓度数据。在药效学检测指标发生改变的时间区间内(1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0、5.0和6.0 h),将各指标成分的血药浓度数据取自然对数值后,与校正“时滞效应”后的药效学指标数据进行拟合,并以得到回归曲线的斜率为权重,将不同时间点各指标成分浓度的自然对数值分别进行加权组合,求得各时间点的“组合血药浓度”,并与校正“时滞效应”后该时间点的药效学数据进行相关分析。结果发现,“组合血药浓度”与30/s切变率下全血黏度与血浆黏度的下降率存在明显的全程相关性,说明采用PK-PD拟合后,以回归曲线的显著性系数作为药效物质基础评价的定性指标、以曲线斜率作为其定量指标,即对药效贡献大小(包括协同与拮抗作用)的综合评价模式是可行的。三七总皂苷与葛根总黄酮配伍使用时,引起急性血瘀证模型大鼠全血黏度发生变化的药效物质基础可能为包括葛根素、大豆苷、3’-羟基葛根素、三七皂苷R1和人参皂苷Rg1等在内的28个化学成分;引起急性血疲证模型大鼠血浆黏度发生变化的药效物质基础可能为包括3’-羟基葛根素、6”-O-木糖基葛根素、葛根素芹菜糖苷、三七皂苷R1和人参皂苷Rgi等在内的34个化学成分。本研究通过建立“组合血药浓度”-药效学模型,进行了三七总皂苷配伍葛根总黄酮对大鼠急性血瘀证干预作用的药效物质基础研究,旨在为中药及其复方药效物质基础的系统研究模式构建示范性平台,解决目前药效物质基础研究中的瓶颈问题。