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猪繁殖与呼吸综合征(Porcine reproductive and respiratorysyndrome,PRRS)是由PRRS病毒(Porcine reproductive and respiratorysyndrome virus,PRRSV)引起的猪的一种繁殖障碍和呼吸系统传染病,主要引起妊娠母猪流产、死胎和产木乃伊胎,仔猪表现为呼吸障碍。PRRS已成为全球养猪业中最严重的疾病之一,我国于1996年首次发现此病,PRRS给我国养猪业造成了极大的损失。目前,防治PRRS的常用方法是接种疫苗,市场上常用的PRRS疫苗主要有减毒活疫苗(Modified live vaccine,MLV)和灭活疫苗(Inactivated vaccine,IV),减毒活疫苗保护性好,但因RNA病毒变异频繁导致疫苗具有很强的毒株特异性,且存在病毒基因重组和毒力返强的危险。灭活疫苗安全性好,但不能诱导足够的细胞免疫,也不能提供足够的保护力,亟需有效的疫苗佐剂增强其免疫反应。树突状细胞(Dendritic cells,DCs)是功能最强大的抗原递呈细胞,其表面表达许多模式识别受体(Pattern recognition receptors,PRR),DCs能够识别捕获并加工处理抗原,将其递呈给体内初始型T细胞,引起T细胞的分化,从而将先天性免疫和获得性免疫联系起来。Toll样受体(Toll-like receptors,TLRs)是表达于DCs表面的一类重要的PRR,可特异性识别病原相关分子模式(pathogen-associated molecular patterns,PAMP),启动下游的信号传导通路,引起炎性细胞因子、I型干扰素、趋化因子和抗菌肽的分泌,激活中性粒细胞和巨噬细胞直接杀伤病原体,在先天性免疫防御和获得性免疫防御中起重要作用。蛋白质组学对于研究生命活动规律,阐明疾病机理及找寻疾病的早期分子标志有重要意义。随着蛋白质组学技术的发展及应用日益广泛,其研究方法也不断更新。2004年,美国应用生物系统公司推出了新的蛋白质组学研究技术同位素相对标记和绝对定量技术(isobaric tags for relative and absolute quantitation,iTRAQ)。该技术具有定量敏感、反应迅速、标记完全、重复性高、高通量、定性定量同时进行的特点,已在微生物、动植物、神经组织等领域有所应用。1、TLR3、7配体与PRRSV灭活抗原不同组合感染Mo DCs的试验本试验将TLR3配体poly(I:C)及TLR7配体imiquimod与PRRSV灭活抗原不同组合孵育Mo DCs。我们首先运用real time PCR的方法,对各组细胞Th1型细胞因子和th2型细胞因子mrna的表达量进行了测定,然后elisa检测各组细胞上清中th1型细胞因子与th2型细胞因子的蛋白分泌量。结果显示,poly(i:c)-imiquimod-prrsv灭活抗原孵育组中,th1型细胞因子与th2型细胞因子mrna及蛋白的表达量显著高于其他各组(p<0.05)。为了阐明tlr3、7配体增强modcs对prrsv灭活抗原的免疫应答机制,我们检测各组细胞不同时间点tlr信号通路节点分子的trif、myd88及nf-κbp65mrna水平及各组细胞不同时间点中细胞质蛋白trif、myd88及磷酸化-iκbα和细胞核蛋白中nf-κbp65的蛋白表达量的变化。结果显示,与prrsv灭活抗原孵育组相比,poly(i:c)-imiquimod-prrsv灭活抗原孵育组中trif、myd88及nf-κbp65的mrna水平在8h都显著升高,细胞质蛋白中trif、myd88及磷酸化-iκbα的蛋白表达量在8h和12h均有明显升高,细胞核蛋白中nf-κbp65的蛋白水平呈现逐渐增加的趋势,其他各组均未能引起通路下游nf-κbp65和磷酸化-iκbα表达量的变化。同时,nf-κb抑制剂bay11-7082预处理poly(i:c)-imiquimod-prrsv灭活抗原孵育组细胞后,其细胞因子mrna的表达量回落到本底水平,由此实验可知,协同使用poly(i:c)、imiquimod及prrsv灭活抗原激活了modcs中trif/myd88-nf-κb信号通路并由此引起了细胞因子的分泌,其中nf-κb对细胞因子的分泌起到了关键性的调节作用。另外,流式细胞仪对各处理组modcs吞噬prrsv的能力进行了测定。结果表明,tlr3、7配体能够增强modcs的吞噬能力,且poly(i:c)、imiquimod合用的增强效果最显著(p<0.05)。2、tlr3、7配体与prrsv灭活抗原不同组合免疫小鼠的试验小鼠免疫试验中,我们将tlr3、7配体与prrsv灭活抗原不同组合后免疫小鼠,结果显示,poly(i:c)-imiquimod-prrsv灭活抗原免疫组小鼠中淋巴细胞增殖及脾淋巴细胞中cd4+、cd8+t细胞的百分含量显著高于其他各组(p<0.05)。poly(i:c)与imiquimod合用作为佐剂免疫后的小鼠脾脏树突状细胞既能够显著促进th1型t细胞的增殖又可显著促进th2型t细胞的增殖(p<0.05)。poly(i:c)-imiquimod-prrsv灭活抗原免疫组小鼠血清中th1型细胞因子和th2型细胞因子的浓度及血清中和抗体滴度显著高于其他各组(p<0.05)。3、高致病性prrsvsd-jn感染modcs蛋白质组学分析试验itraq试验共检测到252个表达变化差异显著的蛋白(p≤0.05且ratios≥1.5-fold或ratios≤0.67)。对此差异蛋白进行了go分析、kegg通路分析和cog分析。结果显示,所有差异显著变化蛋白中与PRRSV受体相关的波形蛋白(vimentin)和清道夫受体(CD163)的表达量显著变化。与内吞(endocytosis)clathrin依赖途径中的clathrin相关蛋白如clathrin重链蛋白(clathrin heavy chain,CLTC),clathrin轻链蛋白(clathrin light chain,CLTA),磷脂酰肌醇结合网格蛋白(phosphatidylinositol-binding clathrin assembly protein,PICALM)和apetela 2蛋白(AP2)的表达量显著升高。与抗原递呈有关的MHC II类分子SLA-DR的表达量显著升高。与JAK-STAT信号通路相关蛋白及其下游因子中的STAT1、Mx1、Mx2和OAS2的表达量显著升高。与actin细胞骨架有关的支架蛋白(Ras GTPase-activating-like protein,IQGAP)包括IQGAP1和IQGAP2的表达量显著下降。我们用western blot的方法对PICALM、STAT1和Mx1蛋白的变化进行了验证,验证结果与i TRAQ分析结果一致。为了更好地了解PRRSV与MoDCs的相互作用,我们用STRING(Search Tool for the Retrieval of Interacting Genes/Proteins)软件对变化差异显著蛋白的相互关系进行了预测,结果发现,变化差异显著的蛋白主要集中在核糖体,内质网和生物代谢途径中。综上所述,联合使用TLR3、7配体可通过TLR/My D88-NF-κB信号通路增强Mo DCs的抗原递呈功能,并增强了小鼠对PRRSV灭活抗原的免疫反应。TLR3、7配体的组合可作为PRRS灭活疫苗的新型候选免疫佐剂。蛋白质组学的iTRAQ分析结果为进一步了解PRRSV感染Mo DCs的免疫机制和致病机制奠定了基础。