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Trienomycin A属于安莎霉素家族C-17类化合物,对HeLa-S3宫颈癌细胞毒有显著活性。该化合物目前已有相关的化学合成研究报道,但因合成过程繁琐且不绿色环保使其在结构改造、活性优化等方面的研究进展缓慢。突变生物合成是一种新兴的生物合成方法,其在基因突变菌株的基础上快速简单的获得一系列结构类似化合物,从而进行结构改造和活性的研究,具有绿色环保、针对性强等优势。本文针对ansamycins的发现和合成中存在的问题,利用突变生物合成获得一系列ansamycins类化合物,并对化合物进行活性评价。本论文主要研究内容如下:研究对象的确定:对本课题组菌种库进行筛选,发现汉城链霉菌Streptomyces.seoulensis IFB-A01可以产生4个安莎霉素类化合物(1-4),包括3个三烯安莎霉素(1、3和4)和1个二烯安莎霉素(2)。表明该菌株有产生ansamycins类化合物的能力,可用于后续研究。另外我们首次利用体外酶催化方法研究了trienomycin A完整的后修饰过程:trienomycin A(1)经过单加氧酶催化形成mycotrienin Ⅱ(3),mycotrienin Ⅱ自动氧化形成 mycotrienin Ⅰ(4),mycotrienin I自动进行体内环化加成反应生成终产物benzoxazomycin(2),阐述了二烯化合物的生物合成途径。基因簇的获得:建立S.seoulensis IFB-A01基因组fosmid文库,同时以AHBA合成酶基因和chcA合成酶基因作为探针对文库进行筛选,对筛选得到的fosmid质粒进行测序,获得28634 bp的连续序列。该序列包含15个开放阅读框,其中包括6个与起始单元AHBA合成相关的基因,4个与起始单元CHC合成相关的基因,这些基因与已报道的天蓝色链霉菌的ansatrienin生物合成基因簇序列相似度达到90%以上。突变菌株的获得:通过对培养基的选择优化确定S.seoulensis IFB-A01基因敲除的方法,并使用该方法对负责trienomycinA生物合成前体的基因(ansB4、ansA1-A4、ansA1-B5)分别进行敲除,获得3株基因缺失菌株(IFB-A01-1,IFB-A01-2和IFB-A01-3)。对这3株突变菌株进行产物检测发现ansB4基因缺失后菌株(IFB-A01-1)仍具备产生trienomycinA的能力,但产量有所降低,这表明S.seoulensis IFB-A01基因组中含有ansB4的同源基因,可以代替ansB4基因合成相应功能的蛋白;ansA1-A4以及ansA1-B5基因缺失后菌株(IFB-A01-2和IFB-A01-3)完全丧失产生trienomycin A的能力。将天然合成前体1-cyclohexenylcarbonyl acid(CHC)投喂入后 IFB-A01-2 和 IFB-A01-3 的发酵液中进行产物回复,发现ansA1-A4基因敲除菌株(IFB-A01-2)可以恢复产生trienomycin A的能力;但ansA1-B5基因缺失菌株(IFB-A01-3)无法恢复产生trienomycin A的能力,分析原因是因为两个合成酶基因簇的敲除影响到下游基因的表达,进而使得菌株丧失产生trienomycin A的能力。突变菌株IFB-A01-2的突变合成及底物宽泛性的研究:突变菌株根据天然前体的结构,设计10个结构类似前体对基因敲除菌株IFB-A01-2进行突变合成实验。初步喂养结果表明有4个非天然前体可以被突变菌株利用以产生新化合物。对非天然前体投喂浓度进行摸索,发现3mM为最适合的投喂浓度。我们进而大规模发酵并投喂前体以对相关新化合物进行分离,分离并鉴定6个化合物(5-10)。与此同时,我们对突变菌株的发酵产物进行分离,分离并鉴定4个化合物(11-14)。对获得的部分新生物合成产物进行抗肿瘤细胞的活性测定,发现生物合成产物5和13的抗肿瘤细胞HepG2和MCF-7的活性要明显强于原化合物1,表明化合物1支链上环己酸结构的改变可以明显的影响化合物的活性;将化合物2、6和7对巨噬细胞的细胞毒活性与化合物1、5和13比较发现,Trienomycins类化合物的C-19和C-5、C-4和N-20的体内环化可以明显降低对巨噬细胞的细胞毒活性,同时化合物6和7在10 ⒚M时对LPS诱导的RAW264.7细胞释放IL-6的抑制作用也较2有大幅度提高。总之,本工作利用体外催化完善trienomycins的后修饰过程;建立了安莎霉素的突变生物合成新方法,利用其合成出一系列安莎霉素衍生物,为此类化合物的构效关系深入研究开辟了道路,同时也为后续新化合物的研究提供保障。