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[目 的]探讨灯盏花乙素在新生大鼠缺氧缺血性脑损伤中的治疗效果,并研究灯盏花乙素治疗新生大鼠HIE的潜在作用机制。[方 法]1.应用原代皮质神经元构建OGD模型体外模拟新生鼠缺氧缺血性脑损伤,结合RNA干扰技术,探讨灯盏花乙素对氧糖剥夺神经元的影响及其潜在作用机制。2.采用网络药理学和生物信息学预测灯盏花乙素和新生儿缺氧缺血性脑病的相关靶点,筛选灯盏花乙素治疗HIE的潜在作用通路及机制。3.采用经典Vannucci法构建新生鼠缺氧缺血性脑损伤模型筛选体内灯盏花乙素最佳药物浓度:60只SD大鼠随机分为假手术组(Sham)、HI+生理盐水组(HI+NS)、HI+灯盏花乙素高浓度组(HI+SCUhigh)、HI+灯盏花乙素中浓度组(HI+SCUmedium)和HI+灯盏花乙素低浓度组(HI+Sculow),每组10只。采用TTC染色评价模型构建是否成功,以及药物对缺氧缺血造成的损伤的缓解作用;对各组动物进行Zea-longa、水迷宫、转棒、旷场和Y迷宫等行为学评价,应用QRT-PCR检测相关信号通路分子或基因的表达水平。4.构建GAP43基因敲除大鼠,采用经典Vannucci法构建新生鼠HIE模型,40只SD大鼠,随机分为假手术组(Sham)、GAP43 野生型+生理盐水组(GAP43+/++HI+NS)、GAP43 野生型+灯盏花乙素组(GAP43+/++HI+SCU)、GAP43基因敲除+灯盏花乙素组(GAP43-/-+HI+SCU),结合TTC染色和Zea-longa、水迷宫、转棒、旷场、Y迷宫等行为学评价,应用QRT-PCR检测相关信号通路分子或基因的表达水平,进一步验证GAP43敲除后灯盏花乙素与差异表达基因的关系。[结果]一、体外实验:1.灯盏花乙素能够显著增加OGD神经元的数量和活力(P<0.05)。TUNEL染色结果显示,灯盏花乙素显著降低了 OGD细胞凋亡(P<0.05)。2.qRT-PCR检测结果显示,灯盏花乙素治疗后神经元中的GAP43表达升高(P<0.05)。3.GAP43干扰实验结果表明,GAP43干扰之后,灯盏花乙素促进细胞增殖和抑制细胞凋亡的现象被逆转,即与OGD+Scu+NC组相比,OGD+Scu+GAP43-si组的细胞凋亡增加(P<0.05);4.免疫荧光染色显示,与OGD+Scu+NC组相比,OGD+Scu+GAP43-si组的Tuj阳性细胞数量减少(P<0.05)。5.QRT-PCR结果显示,GAP43干扰之后,神经元中的JAK2、STAT3和PTN表达均显著升高,差异有统计学意义(P<0.05)。二、灯盏花乙素靶蛋白预测:1.DRUGBANK、STITCH、SwissTargetPrediction、TCMSP 和 PUBCHEM 等数据库对灯盏花乙素潜在的作用靶点进行了预测。总共筛选到224个靶点,除去重复的共筛选到206个灯盏花乙素特有的靶点。。2.Genecard、Disgenet和OMIM等数据库查询了新生儿缺氧缺血性脑病的疾病靶点。总共筛选到1476个靶点,除去重复的共筛选到1161个HIE特有的靶点。3.GO分析和KEGG通路分析表明,80个靶点总共参与了 1721个GO条目。4.GeneMania分析表明JAK2、STAT3与GAP43和PTN之间存在相互作用关系。三、体内药物浓度筛选及GAP43 Knockout大鼠体内验证1.TTC染色结果显示:中浓度组(20mg/kg)灯盏花乙素能够显著降低大鼠脑梗死比例(P<0.001)。2.Zea-longa评分结果显示:灯盏花乙素显著改善了 HIE大鼠的神经功能缺损症状(P<0.05);3.水迷宫和Y迷宫实验结果显示:灯盏花乙素显著改善了 HIE大鼠的空间学习和记忆能力(P<0.05);4转棒实验结果显示:灯盏花乙素显著改善了 HIE大鼠的躯体运动功能(P<0.05);5.旷场实验结果显示,灯盏花乙素改善了HIE大鼠暴露在新环境下的焦虑抑郁样行为(P<0.05)。6.GAP43 Knockout大鼠体内验证:TTC染色结果显示:与野生型大鼠相比,纯合子大鼠的脑梗死比例和脑水肿显著加重,差异有统计学意义(P<0.001)。Zea-longa评分显示:在术后第8天,GAP43+/++HI+Scu组恢复至正常,而GAP43+/++HI和GAP43-/-+HI+Scu组在第9天恢复至正常。水迷宫和Y迷宫结果显示:灯盏花乙素显著改善了 GAP43野生型大鼠的空间学习和记忆能力,差异均有统计学意义(P<0.05)。然而GAP43 KO大鼠的学习和记忆能力没有得到明显的改善。转棒结果显示:与GAP43+/++HI+Scu组相比,GAP43-/-+HI+Scu组大鼠在转棒上的最长停留时间显著降低(P<0.05)。旷场结果显示:与GAP43-/-+HI+Scu组相比,GAP43-/-+HI+Scu组大鼠的理毛次数、外周潜伏期和中心潜伏期显著升高,外周路程、总新路程和站立次数显著降低,差异有统计学意义(P<0.05)。QRT-PCR检测结果显示:GAP43+/++HI+Scu组大鼠皮质中的GAP43表达升高,PTN、JAK2、STAT3 表达降低(P<0.05);此外,GAP43-/-+HI+Scu 组大鼠皮质中 JAK2、STAT3、PTN表达显著升高(P<0.05)。[结 论]1.灯盏花乙素能够显著改善HIE大鼠的学习记忆和运动功能。2.灯盏花乙素改善HIE大鼠的学习记忆和运动功能的作用与GAP43有关。3.灯盏花乙素治疗改善HIE大鼠的学习记忆和运动功能的作用与JAK2/STAT3/PTN/GAP43 信号通路有关。