【摘 要】
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高盐废水具有高盐、高有机物、高氮含量的特性,若直接排放到环境中,会造成严重水体污染。传统生物脱氮处理法使用的细菌通常耐盐性能较弱,而高盐废水具有高渗透压,因而采用传统生物脱氮处理法处理高盐废水效率较低。异养硝化-好氧反硝化（HN-AD）细菌通常具有一定程度耐盐性能,近年来正逐渐成为研究热点。本论文利用早期筛选的一株具有耐盐性能的盐单胞菌CD01（Halomonas sp.CD01）开展了培养条件和
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高盐废水具有高盐、高有机物、高氮含量的特性,若直接排放到环境中,会造成严重水体污染。传统生物脱氮处理法使用的细菌通常耐盐性能较弱,而高盐废水具有高渗透压,因而采用传统生物脱氮处理法处理高盐废水效率较低。异养硝化-好氧反硝化（HN-AD）细菌通常具有一定程度耐盐性能,近年来正逐渐成为研究热点。本论文利用早期筛选的一株具有耐盐性能的盐单胞菌CD01（Halomonas sp.CD01）开展了培养条件和脱氮参数优化研究,分析了其生理生化特性,验证了其异养硝化-好氧反硝化功能;同时提取不同盐度条件下Halomonas sp.CD01的总RNA进行高通量测序,开展了转录组学研究,分析了Halomonas sp.CD01脱氮相关基因表达差异特性,解析了高盐条件下Halomonas sp.CD01异养硝化-好氧反硝化路径上的关键基因;并针对关键基因进行敲除和回补,验证相关基因功能;构建了异养硝化-好氧反硝化工程菌株,对其耐盐和脱氮性能进行了验证。本论文的主要研究成果如下:利用单因素实验法,研究了盐度、碳源、氮源、碳氮比、温度、p H等培养条件对Halomonas sp.CD01生长状况和脱氮性能的影响,并验证了其异养硝化-好氧反硝化功能。研究得到Halomonas sp.CD01生长和脱氮最适培养条件为:盐度为7%,碳源为葡萄糖,氮源为NH4Cl与Na NO3复合氮源,碳氮比为9:1,温度为30°C,p H为7。在最适培养条件下,Halomonas sp.CD01的细胞干重（CDW）可达到12.7±0.8 g/L,化学需氧量（COD）去除率为77.7±2.9%,NH4+-N去除率为76.0±6.5%,NO2--N去除率为78.7±2.9%,NO3--N去除率为76.0±3.7%。此外,Halomonas sp.CD01同时具有异养硝化和好氧反硝化功能,属于典型的异养硝化-好氧反硝化菌株,且该菌还具有一定程度的缺氧反硝化能力。分别提取盐度为7%和11%时Halomonas sp.CD01的总RNA进行高通量测序,进行转录组学分析,解析了其基因差异表达水平。共筛选到307个显著差异表达基因,其中上调基因190个,下调基因117个,主要集中在细胞过程、代谢过程、细胞解剖实体、催化活性、蛋白结合以及转运蛋白活性等方面;KEGG注释与富集分析表明,高盐条件下Halomonas sp.CD01无机氮代谢、氨基酸代谢、能量物质和废弃物质相关ABC转运蛋白基因表达受到抑制,而相容性溶质相关ABC转运蛋白基因表达上调。结果表明,高盐条件下Halomonas sp.CD01的生理功能和基因表达水平受到显著影响,脱氮性能被抑制,但细胞仍通过合成和积累相容性溶质维持胞内渗透压稳定;同时,推测amo A与nar H为Halomonas sp.CD01异养硝化-好氧反硝化路径上的关键基因。针对Halomonas sp.CD01关键的amo A与nar H基因进行敲除和回补,验证其在脱氮路径上的作用;构建重组质粒载体并进行同源表达,研究了工程菌的脱氮性能和基因表达水平变化。当敲除amo A之后,Halomonas sp.CD01的氨氮去除率为37.8±4.2%,较野生型下降了38.2%;而敲除nar H基因之后,硝态氮去除率为14.1±1.3%,较野生型下降了61.9%。将两个基因分别进行回补后,氨氮去除率回升到72.6±4.5%,硝态氮去除率回升到69.4±3.2%。结果表明,amo A与nar H基因在Halomonas sp.CD01的HN-AD路径上发挥重要作用,且nar H基因更为关键。将nar H与p SB3K3质粒进行同源重组,构建过表达重组载体,导入Halomonas sp.CD01细胞,筛选阳性克隆子,并且该工程菌株的氨氮和硝态氮去除率分别上升到92.6±6.1%和93.4±5.3%,nar H基因表达量为野生型菌株的2.7倍。以上研究成果表明,Halomonas sp.CD01具有异养硝化-好氧反硝化功能,在7%盐度条件下能够正常行使脱氮功能,在异养硝化-好氧反硝化代谢过程中amo A与nar H基因是脱氮路径上关键基因,所构建nar H基因过表达的工程菌株具有较好的脱氮效率。
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