肺癌是世界范围内发病率最高的恶性肿瘤,也居我国恶性肿瘤发病率及死因首位。根据病理类型不同,肺癌可分为小细胞肺癌和非小细胞肺癌(non-small cell lung cancer,NSCLC),其中非小细胞肺癌是最常见的病理类型,占肺癌总数的85%左右。随着近年来我国大气污染的恶化及吸烟人群的持续增长,肺癌发病率仍呈逐年升高趋势。虽然近年来某些肺癌亚型患者的治愈率和生存期有所提高,但其总体治疗效果仍不理想,迫切需要探寻影响非小细胞肺癌发生发展的相关因素和参与机制,为其治疗策略改进提供理论依据。肿瘤干细胞(cancer stem cells,CSCs)是恶性肿瘤无限增殖和复发的根源,近年来一直是肿瘤领域的研究热点;CSCs与肿瘤细胞增殖、侵袭转移、治疗抵抗等多种恶性表型密切相关。研究表明,CSCs在非小细胞肺癌发生、发展及耐药等具有关键作用,针对肿瘤干细胞的治疗策略已成为肺癌等肿瘤治疗的重要发展方向之一。目前应用较多的肺癌CSCs标记物包括ALDH、CD133及ABCG2等。但是调控非小细胞肺癌CSCs比例、功能的具体机制尚不十分明确。Wnt/β-catenin信号通路是细胞内的重要信号传导机制之一,参与调控机体的多种生理过程,其异常表达和调控参与多种疾病,特别是肿瘤的发生和发展过程。该通路因其启动蛋白WNT而得名,WNT是一种富含半胱氨酸的糖蛋白,当其与细胞膜表面的Frizzled家族跨膜蛋白受体结合后,即可激活经典的WNT/β-catenin信号通路,使得胞浆内的β-catenin得以稳定存在,部分β-catenin进入细胞核与TCF/LEF转录因子家族作用并促进特定靶基因的表达。已有的研究证实,Wnt/β-catenin通路在肿瘤发生、肿瘤血管生成和肿瘤干细胞自我更新中均具有重要作用;但其在肿瘤微环境中对非小细胞肺癌不同病理类型CSCs的调控作用和参与因子相关研究尚少。乏氧是实体肿瘤微环境的重要特征之一,其不仅影响肿瘤细胞本身的生物学行为,而且也可能会显著影响CSCs的多种特性,包括干细胞比例、侵袭转移能力及对药物的敏感性等。研究肿瘤乏氧微环境下CSCs的调控机制和参与分子,可更好的反应参与肿瘤局部CSCs特性的调控通路和机制,目前相关报道较少,并可为非小细胞肺癌恶性表型和治疗策略改进提供更为精确的理论依据。本课题研究了乏氧微环境下Wnt/β-catenin信号通路对非小细胞肺癌(包括不同类型肺癌细胞:肺腺癌A549细胞和肺鳞癌H520细胞)肿瘤干细胞比例及侵袭能力的影响;并对非小细胞肺癌患者临床病理标本Wnt/β-catenin通路表达、乏氧关键调控因子HIF-1α进行了检测,分析二者之间的相关性及与患者生存预后的关系,为体外研究的结果提供了进一步验证。碱性成纤维细胞生长因子(basic fibroblastgrowth factor,bFGF)在包括肺癌在内的多种恶性肿瘤中广泛表达,其不仅在机体骨髓间充质干细胞、胚胎干细胞等正常干细胞自我更新中起到重要作用,而且也参与CSCs的干性维持及侵袭、治疗耐药等过程;但其表达与Wnt/β-catenin信号通路的关系尚不明确。因此,本课题也探讨了 Wnt/β-catenin信号通路是否能调控bFGF的表达,进而影响CSC所致的化疗耐药,以从bFGF角度探讨Wnt/β-catenin通路调控CSCs的参与因子和机制。第一部分乏氧微环境下Wnt/β-catenin通路对非小细胞肺癌肿瘤干细胞比例及侵袭能力的影响目的:乏氧是肿瘤微环境的重要特征,其可影响非小细胞肺癌的多种恶性生物学行为;该部分研究主要探讨肿瘤乏氧微环境下Wnt/β-catenin信号通路对非小细胞肺癌肿瘤干细胞比例及侵袭能力的影响。非小细胞肺癌主要包括肺腺癌和肺鳞癌等类型,大量基础和临床研究已经证实肺腺癌和肺鳞癌具有不同的生物学特性和基因/分子表达;因此,我们分别对肺腺癌A549细胞和肺鳞癌H520细胞进行了相关研究。方法:1.分别在常氧(21%O2、5%CO2)和乏氧(1%O2、5%CO2和94%N2混合气体)条件下在培养肺腺癌A549细胞和肺鳞癌H520细胞;培养48 h后,提取细胞总蛋白,western blot检测β-catenin的表达改变;2.同上分别在常氧和乏氧条件下培养肺腺癌A549细胞和肺鳞癌H520细胞,按照ALDEFLUORTM ASSAY试剂盒说明书要求处理和孵育细胞,流式细胞仪分别检测A549细胞和H520细胞中ALDH+细胞比例,研究乏氧对ALDH+细胞比例的影响;3.常氧条件下分别培养A549细胞和H520细胞,加入Wnt通路抑制剂XAV939处理细胞,western blot检测β-catenin的表达改变,并采用ALDEFLUORTM ASSAY检测其中ALDH+细胞比例改变;4.分别在常氧和乏氧条件下在培养肺腺癌A549细胞和肺鳞癌H520细胞,通过Matrigel基质胶包被的Transwell小室系统检测乏氧对A549、H520细胞侵袭能力的影响;5.HIF家族基因(HIF1α、HIF2α等)是细胞对乏氧应答的关键调控基因。分别在常氧和乏氧条件下培养A549细胞和H520细胞,提取细胞RNA,qRT-PCR检测HIF1α、HIF2α mRNA的表达水平,western blot检测HIF1α蛋白水平的表达改变。6.在常氧条件下培养的A549细胞和H520细胞中加入特异性抑制剂抑制Wnt通路后,western blot检测HIF1α蛋白的表达。结果:1.分别在常氧和乏氧条件下培养肺腺癌A549细胞,检测Wnt/β-catenin信号通路的表达,发现乏氧培养48 h后β-catenin信表达显著下调:ALDEFLUO ASSAY检测表明,乏氧培养48 h后肺腺癌A549细胞中ALDH+细胞比例显著下降(P<0.05);2.而分别在常氧和乏氧条件下培养肺鳞癌H520细胞,western blot检测Wnt/β-catenin信号通路的表达则发现乏氧培养48 h后β-catenin信表达显著上调;ALDEFLUO ASSAY检测表明,乏氧培养48h后H520细胞中ALDH+细胞比例显著上升(P<0.05);这说明乏氧对肺腺癌和肺鳞癌ALDH+细胞比例具有不同的调控作用。3.常氧条件下在A549细胞和H520细胞中加入Wnt通路抑制剂XAV939后,β-catenin表达均显著下降;ALDEFLUO ASSAY检测结果表明,无论是A549细胞还是H520细胞,其中的ALDH+细胞比例则显著下降;4.Transwell侵袭试验检测乏氧对A549、H520细胞侵袭能力的影响,结果表明,肺腺癌A549细胞和肺鳞癌H520细胞的侵袭能力均显著增强(P<0.05);5.乏氧显著上调A549细胞和H520细胞中HIF1α mRNA的表达,而HIF2α mRNA的表达常氧和乏氧条件下未见显著差异;western blot检测结果进一步证实HIF1α蛋白水平表达也显著增高;6.采用特异性抑制剂抑制Wnt通路表达后,HIF1α的表达也显著下降;这提示,乏氧和Wnt/β-catenin信号通路存在相互调控作用。结论:乏氧可显著下降肺腺癌A549细胞中β-catenin的表达,而且其中ALDH+细胞比例也显著下降;在肺鳞癌H520细胞中β-catenin的表达则显著上升,其ALDH+细胞比例却显著上升,这说明乏氧对肺腺癌和肺鳞癌ALDH+细胞比例具有不同的调控作用。在A549细胞和H520细胞中加入Wnt通路抑制剂抑制其激活后,β-catenin表达均显著下降,而且无论是A549细胞还是H520细胞中的ALDH+细胞比例则显著下降。乏氧显著促进肺腺癌A549细胞和肺鳞癌H520细胞的侵袭能力。乏氧显著上调A549细胞和H520细胞中HIF1α mRNA和蛋白水平的表达,采用特异性抑制剂抑制Wnt通路表达后,HIF1α的表达下调,提示乏氧和Wnt/β-catenin信号通路存在相互调控作用。第二部分非小细胞肺癌患者病理组织β-catenin、HIF-1α表达相关性分析及对患者生存预后的影响目的:在晚期非小细胞肺癌患者肿瘤组织中检测β-catenin、HIF-1α的表达,统计学分析其表达的相关性;随访非小细胞肺癌患者生存预后,分析β-catenin表达对患者生存期的影响;该部分临床病理组织检测的分析结果,可为第一部分实验室研究的结果提供间接验证。方法:1.收集76例晚期非小细胞肺癌患者临床病理资料,包括患者性别、年龄、吸烟史、病理类型、分化程度、淋巴结转移情况等;随访其总生存期(Overall survival,OS);同时收集这些患者的病理组织标本;2.免疫组化检测76例晚期非小细胞肺癌患者病理组织β-catenin、HIF-1α的表达,利用卡方检验分析二者表达的相关性;3.利用Kaplan-Meier生存分析研究β-catenin表达与患者OS的相关性。结果:1.免疫组化检测结果发现,β-catenin在晚期非小细胞肺癌患者病理组织中具有较高的表达率(阳性率>85%),其表达与肿瘤分化程度有关,与其他临床病理因素无显著相关性。HIF-1α在非小细胞肺癌患者病理组织中有不同程度的表达,统计学分析未发现其与患者临床病理因素显著相关;2.Spearman检验分析表明,β-catenin表达与HIF-1α表达具有相关性(P<0.001);3.生存分析表明,β-catenin高表达的晚期非小细胞肺癌患者生存预后显著差于低表达组(P<0.01)。结论:1.在晚期非小细胞肺癌患者病理组织中可检测到不同程度的β-catenin和HIF-1α的表达,并且前者表达与TNM分期有关。2.统计学分析证实,β-catenin和HIF-1α表达之间具有相关性;3.β-catenin表达与患者生存预后有关,高表达的非小细胞肺癌患者OS均显著低于低表达者。4.非小细胞肺癌患者病理组织检测的结果进一步验证了第一部分体外研究的结果,也为非小细胞肺癌患者预后预测提供更多分子指标和依据。第三部分Wnt/β-catenin通路调控bFGF表达对非小细胞肺癌细胞株肿瘤干细胞的影响目的:研究Wnt/β-catenin信号通路是否通过调控bFGF的表达影响非小细胞肺癌肿瘤干细胞特性(包括OCT-4表达、化疗耐药等)。方法:1.分别采用Wnt通路突变激活质粒pcDNA3-S33Y-β-catenin和对照质粒pcDNA3转染肺癌A549细胞,通过G418筛选转染成功的细胞;western blot检测结β-catenin的表达,验证是否成功建立了过表达β-catenin的细胞株;2.qRT-PCR和western blot检测bFGF在β-catenin过表达细胞株和对照细胞株的表达,探讨Wnt/β-catenin信号通路是否可调控bFGF的表达;3.采用siRNA干扰的方法敲减bFGF在A549细胞的表达,qRT-PCR和western blot验证敲减效果;4.siRNA敲减bFGF在A549细胞表达后,分别采用CCK-8试剂盒检测细胞活力和流式细胞术检测细胞凋亡的方法,探讨bFGF对A549顺铂敏感性(细胞活力抑制和诱导凋亡等)的影响;5.bFGF siRNA下调A549细胞bFGF表达后,克隆形成试验检测其对A549细胞克隆形成能力的影响;western blot检测其对CSCs关键调控基因OCT-4表达的影响。结果:1.质粒转染后western blot检测结果表明,与对照及A549细胞相比,β-catenin表达显著上调,这说明成功建立了 β-catenin过表达细胞A549细胞株及对照细胞株。2.与对照细胞株相比,β-catenin过表达细胞株bFGFmRNA水平和蛋白水平的表达均显著上调,这说明Wnt/β-catenin信号通路激活可促进bFGF的表达;3.bFGF siRNA明显抑制bFGF在A549细胞的表达,无论是mRNA水平还是蛋白水平;4.与对照siRNA处理组相比,bFGF siRNA明显增强不同浓度顺铂(2.5,5,and 10 μg/mL)对A549细胞的抑制作用。bFGFsiRNA并未显著影响A549细胞的凋亡率,但是其可显著促进顺铂所诱导的凋亡(26.67%± 2.59%vs.9.05%± 1.20%,P<0.05)。5.bFGFsiRNA下调A549细胞bFGF表达后,克隆形成试验检测发现,A549细胞克隆形成率显著下降(P<0.05),而且western blot结果表明OCT-4的表达也显著下调。结论:Wnt/β-catenin信号通路在非小细胞肺癌A549细胞显著促进bFGF的表达,而bFGF可降低A549细胞对顺铂的敏感性。同时,bFGF也促进A549细胞的克隆形成能力和OCT-4的表达。这说明Wnt/β-catenin信号通路可通过调控非小细胞肺癌bFGF的表达并进一步影响其克隆形成能力、化疗耐药及OCT-4表达等肿瘤干细胞特性。