背景:胶质瘤是一种侵袭性的恶性脑肿瘤,参与构成了儿童和成人死亡的主要原因[1]。新诊断的胶质瘤患者的中位生存时间只有14.6个月,即使这些病人已接受了肿瘤外科切除并施以放疗及替莫唑胺(TMZ)化疗[2]。作为烷基化剂TMZ广泛用于治疗原发性和复发性高级别胶质瘤,但其疗效往往受到肿瘤抗药性的限制[3]。因此,更为有效的胶质瘤治疗新药仍为所需。自噬是一种降解途径,自噬体或自噬溶酶体在细胞质中的形成是其形态学上所具有的特征,细胞内物质或受损的细胞器通过自噬体投递到溶酶体以备清除[4]。自噬在调节细胞命运中起着双重作用。一方面,它保护细胞免受有害的刺激的迫害。另一方面,它会导致细胞死亡,这被称为自噬性死亡[4]。据报道,自噬通过清除受损的线粒体来抑制活性氧(ROS)的积累,从而消除顺铂诱导的肝癌细胞死亡[5]。还发现自噬通过去除氧化应激过程中产生的错误折叠蛋白来保护神经母细胞瘤细胞[6]。因此,自噬对细胞损伤的保护与氧化应激的抑制密切相关。在自噬性死亡的情况下,自噬也伴随着细胞内活性氧的积累,通常认为由活性氧所激活[7,8]。然而,自噬是否能通过增加细胞内ROS或诱导线粒体损伤来促进细胞死亡仍不清楚。水飞蓟素是水飞蓟素中最具生物活性的成分,水飞蓟素是奶蓟(水飞蓟属)的多酚提取物。它被广泛应用于治疗和预防多种肝胆疾病,如酒精性肝病、非酒精性脂肪肝和蘑菇中毒[9,10]。此外,水飞蓟宾不仅对乳腺癌细胞、前列腺癌细胞、胶质瘤细胞等多种肿瘤细胞有较强的抑制作用,而且对TMZ、TRAIL或三氧化二砷等化疗药物也有致敏作用,可预防化疗药物顺铂对肝细胞的损伤。虽然水飞蓟宾可以诱导癌细胞自噬死亡,但水飞蓟宾诱导自噬下游的生化事件尚不清楚。因此,本研究以胶质瘤细胞系及裸鼠移植瘤为研究对象,探讨自噬是否具有促进线粒体损伤的作用及其可能机制。目的:在这项研究里,我们利用多种胶质瘤细胞系以及移植了胶质瘤的裸鼠来调查有BNIP3参与的自噬是否促进了水飞蓟宾诱导的胶质瘤细胞死亡。方法:1、通过MTT法检测胶质瘤细胞增殖情况。2、通过LDH释放试验检测胶质瘤细胞死亡率的变化。3、蛋白印迹法(western-blotting)检测胶质瘤细胞及裸鼠组织中相关蛋白含量变化。4、通过流式细胞术检结合JC-1染色检测线粒体膜电位的变化。5、通过荧光显微镜观察JC-1、DCFH-DA、Mitosox染色后胶质瘤细胞形态学上的变化。6、通过激光共聚焦显微镜观察免疫荧光染色后相关蛋白在胶质瘤细胞中的分布情况。7、通过DCFH-DA探针、H2O2检测胶质瘤细胞及裸鼠组织的氧化水平。8、通过构建Stub RFP-Sens GFP-LC3慢病毒转染胶质瘤细胞,观察自噬发生情况。9、通过GSH与半胱氨酸含量的测定,检测胶质瘤细胞及裸鼠组织内还原物质的含量。10、通过Si RNA技术敲除AIF、BNIP3和ATG5基因,来研究他们在水飞蓟宾诱导的AIF的核转位或过度线粒体自噬中的作用。11、通过对Balb/c nude裸鼠接种C6胶质瘤细胞,构建肿瘤移植模型,观察体内环境中水飞蓟宾对胶质瘤的抑制作用。结果:1、MTT法检测水飞蓟宾对U87、U251、SHG-44和C6胶质瘤细胞的杀伤作用呈剂量依赖性。Western blotting分析表明,水飞蓟宾诱导ATG5和LC3-II的时间依赖性上调,而自噬底物p62(SQSTM1)的时间依赖性下调。在共聚焦显微镜下观察到Stub RFP-Sens GFP-LC3B慢病毒感染细胞的代表性图像显示,水飞蓟宾诱导自噬体(黄色斑点)和自溶体(紫色斑点)的形成。Western blotting分析表明,3MA可抑制水飞蓟宾诱导的LC3-II的上调和p62的降低。BafilomycinA1逆转了水飞蓟宾诱导的p62降低,但进一步提高了LC3-II水平。LDH释放实验证明,3MA或bafilomycin A1可预防水飞蓟宾诱导的胶质瘤细胞死亡。Western blotting结果表明,Si RNA敲除ATG5可抑制水飞蓟宾诱导的LC3-II的上调和p62的降低。LDH释放实验表明,Si RNA敲除ATG5后,水飞蓟宾诱导的胶质瘤细胞死亡受抑。2、荧光显微镜下JC-1染色的代表性细胞图像显示,水飞蓟宾处理使U87和U251细胞的红色荧光明显减弱。流式细胞术结合JC-1染色证实,水飞蓟宾诱导线粒体膜电位的时间依赖性耗散。在荧光显微镜下,用Mitosox red染色的细胞的代表性图像显示,在水飞蓟宾处理的细胞中显示的红色荧光明显强于对照组。对Mitosox-red显示的红色荧光强度的统计分析表明,水飞蓟宾以时间依赖的方式触发线粒体超氧化物的积累。Western blotting分析表明,水飞蓟宾诱导AIF从线粒体向细胞核的转移具有时间依赖性。共聚焦显微镜结合免疫化学染色的典型图像显示,水飞蓟宾诱导AIF在U87细胞核内积聚。Si RNA敲除AIF抑制了水飞蓟宾诱导的核内AIF的积累。LDH释放实验证明,AIF基因敲除可阻止水飞蓟宾诱导的胶质瘤细胞死亡。对Mitosox-red荧光强度的统计分析表明,3MA或bafilomycin A1可显著抑制水飞蓟宾诱导的线粒体超氧化物积累。Western blotting证实,Si RNA敲除ATG5可阻止水飞蓟宾诱导的AIF从线粒体向细胞核的转移。Western blotting结果显示,Si RNA敲除ATG5后,siribin诱导的AIF核移位受到抑制。Si RNA敲除ATG5可抑制水飞蓟宾对线粒体超氧化物的影响。3、Western blotting分析表明,水飞蓟宾诱导BNIP3上调,促进线粒体BNIP3积累,且呈时间依赖性。共聚焦显微镜结合免疫细胞化学染色显示,水飞蓟宾诱导的BNIP3上调与线粒体共定位。Si RNA敲除BNIP3抑制水飞蓟宾诱导的BNIP3上调和线粒体堆积。LDH释放实验表明,Si RNA敲除BNIP3可防止水飞蓟宾诱导的胶质瘤细胞死亡。对用Mitosox-red培养的细胞显示的红色荧光强度的统计分析表明,用Si RNA敲除BNIP3可以阻止水飞蓟宾诱导的线粒体超氧化物的积累。流式细胞仪分析结合JC-1染色显示,BNIP3的敲除减轻了水飞蓟宾诱导的线粒体去极化。Western印迹分析显示当BNIP3被Si RNA敲除时,水飞蓟宾诱导的AIF从线粒体向细胞核的转移受到抑制。Western blotting证明,在3MA或bafilomycin A1存在下,水飞蓟宾诱导的BNIP3上调和在线粒体上的积累均受到抑制。4、Western blotting证实,水飞蓟宾诱导HIF-1α表达下调,但GPX4表达上调呈时间依赖性。过氧化氢检测显示水飞蓟宾对胶质瘤细胞内过氧化氢有明显的时间依赖性增加。GSH测定证实,水飞蓟宾治疗导致GSH的时间依赖性耗竭。H2O2测定表明,外源GSH的补充可阻止水飞蓟宾诱导的H2O2升高。LDH释放实验表明,补充GSH可预防水飞蓟宾诱导的胶质瘤细胞死亡。Western blotting结果显示,GSH预处理可阻止水飞蓟宾诱导的BNIP3在线粒体的过度表达和积累。Western blotting结果表明,H2O2不仅诱导了BNIP3的过度表达,而且提高了线粒体中BNIP3的水平。GSH测定表明,3MA或bafilomycin A1可抑制水飞蓟宾诱导的GSH耗竭。H2O2测定表明,用3MA或bafilomycin A1预处理的细胞中,水飞蓟宾诱导的H2O2增加是受逆的。5、半胱氨酸测定表明,水飞蓟宾诱导半胱氨酸的时间依赖性耗竭。Western blotting分析证实,水飞蓟宾下调x CT,而上调p53和磷酸化p53呈时间依赖性。这些都是在3MA或bafilomycin A1存在下受到逆转。半胱氨酸测定表明,在3MA或bafilomycin A1存在下,水飞蓟宾诱导的半胱氨酸耗竭是受抑的。Western blotting结果显示,Si RNA敲除ATG5可阻止水飞蓟宾诱导的CT下调和p53、p-p53的上调。半胱氨酸测定证明,Si RNA敲除ATG5后,水飞蓟宾诱导的半胱氨酸耗竭受到抑制。6、水飞蓟宾以时间依赖的方式耗尽ATP、葡萄糖-6-磷酸和丙酮酸。Western blotting显示水飞蓟宾诱导HK-II、PFKP和PKM2的时间依赖性下调。GSH预处理可防止水飞蓟宾诱导的ATP、葡萄糖-6-磷酸和丙酮酸的耗竭。Western blotting证明,GSH可抑制HK-II、PFKP、PKM2和p62的下调,抑制水飞蓟宾诱导的ATG5和LC3-II的上调。7、水飞蓟宾能抑制皮下荷瘤裸鼠肿瘤的生长。Western blotting分析显示,水飞蓟宾上调ATG5和LC3-II,下调p62。水飞蓟宾处理导致GSH和半胱氨酸的消耗,但增加了过氧化氢。Western blotting分析显示,水飞蓟宾下调x CT,但上调p53和磷酸化p53蛋白。水飞蓟宾还刺激线粒体BNIP3的上调和积累,促进AIF从线粒体向细胞核的转运。水飞蓟宾诱导ATP、葡萄糖-6-磷酸和丙酮酸的耗竭。水飞蓟宾处理导致HK的下调。结论:1、体内体外实验证明,水飞蓟宾能够抑制胶质瘤的生存。2、水飞蓟宾诱导胶质瘤细胞自噬,自噬参与线粒体损伤。3、自噬促进水飞蓟宾诱导BNIP3的表达和线粒体积累。4、自噬通过引起GSH耗竭促进水飞蓟宾诱导的H2O2增加。5、自噬促进水飞蓟宾诱导的半胱氨酸耗竭和p53磷酸化。6、水飞蓟宾抑制胶质瘤细胞糖酵解。