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目的构建能够高效抑制成熟miR-21小分子表达的腺病毒载体,探讨其对肝癌细胞株HepG2生长的影响,以期阐述miR-21在肿瘤形成过程中的分子机制,为临床肝癌治疗提供参考数据和新的思路。方法(1)根据人miR-21基因序列(MIMAT0000077),采用miRNAsponge技术合成一段含有与miR-21序列完全互补的8个重复片段(miR-21S),克隆至穿梭载体pAdTrack-CMV中,经双酶切及测序鉴定;与pAdEasy-1腺病毒骨架质粒同源重组,PacI线性化后利用脂质体将重组表达载体转染到293A细胞包装并大量扩增携带miR-21S基因的重组腺病毒(Ad/miR-21/inhibitor),测定病毒滴度。(2)运用miRanda、Targetscan和PicTar等靶基因预测软件检索miR-21(microRNA-21)可能的靶基因,筛选出保守程度高、结合自由能低,并且与癌症相关的基因作为候选靶基因,通过预测,我们选定MAP2K3为研究的靶基因,然后构建萤火虫荧光素酶表达载体,在293T细胞中验证miR-21与MAP2K3之间的关系。将MAP2K3的3’UTR亚克隆至pMIR-Report质粒荧光素酶报告基因下游,使之能表达融合靶基因3’UTR的重组荧光素酶,将pMIR-Report/MAP2K3重组质粒和pAd/pri-miR-21表达质粒通过脂质体转染方法转染293T细胞,48h后收集细胞,采用双荧光素酶报告基因系统,以海肾荧光素酶作为参照,进行荧光素酶检测。同时采用点突变的方法使MAP2K3-3’UTR中与miR-21的结合位点碱基突变,构建突变质粒pMIR-Report/Mut-MAP2K3,检测其抑制作用是否消失。(3)用制备的Ad/miR-21/inhibitor、Ad/pri-miR-21及Ad/con腺病毒感染HepG2细胞,感染48h后,收集细胞,分别提取microRNAs和总蛋白,通过Real-Time PCR和Western Blot分别检测miR-21和MAP2K3表达水平。(4)用Ad/miR-21/inhibitor腺病毒感染HepG2细胞,分别于24、48、72h后终止刺激,采用MTT法检测细胞的增殖水平,Hochest染色及BCL-2表达检测细胞的凋亡水平。(5)收集宁夏医科大学总医院2006年到2012年手术切除的肝癌组织及癌旁组织14例,免疫组化检测MAP2K3在肝癌及癌旁组织中的表达水平,研究MAP2K3在肝癌中的作用。结果生物信息学分析结果显示miR-21和MAP2K3存在可能的结合位点,且MAP2K3在肝细胞性肝癌组织中低表达,在癌旁组织中表达升高,因此可被认作新的肝癌抑癌基因。通过双荧光素酶报告基因系统证实了miR-21靶向结合MAP2K33’UTR的保守位点抑制其表达;Western blot分析结果显示,过表达miR-21后MAP2K3蛋白质表达降低了3/5(P<0.05),抑制miR-21表达后MAP2K3蛋白质表达增加1.8倍。结果表明,miR-21可以靶向作用MAP2K33’UTR抑制MAP2K3蛋白质的表达。经PCR、酶切、测序及GFP表达证实成功地构建了携带miR-21S基因的重组腺病毒载体并制备出高滴度重组病毒。重组的Ad/miR-21/inhibitor腺病毒可有效抑制HepG2细胞的增殖能力并促进其凋亡,起到了抑制肿瘤生长的效果。结论成功制备人Ad/miR-21/inhibitor重组腺病毒,进一步证实miR-21可以负向调节靶基因MAP2K3的表达并在肝癌发生过程中发挥重要的作用。为今后开展以microRNA-21小分子为靶点的基因治疗研究提供了保障。