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角蛋白是一组几乎存在于所有上皮细胞中的细胞骨架中间丝蛋白。角蛋白具有高抗性的理化特征和特殊的生物学作用，在维持表皮的正常的生理功能中起着重要的作用。角蛋白的表达或功能异常或缺陷可以导致多种皮肤疾病。某些角化过度性皮肤病，角蛋白的异常一方面是其发病的原因，另一方面角化过度也造成了外用药物治疗上的困难。角蛋白酶是微生物分泌的一类具有角蛋白水解活性的酶，能分解角蛋白产生可溶性短肽或氨基酸，作为真菌生长繁殖的氮源和碳源，是皮肤癣菌重要的侵袭性因子。角蛋白酶具有高效的角蛋白水解活性，其在生物医药、美容、废物处理及动物饲料生产等方面具有广阔的应用前景。 目的：获得一种在生物医药、美容领域具有良好应用前景的基因工程角蛋白酶，鉴定其角蛋白水解活性，为今后角蛋白酶的基础研究打下基础，同时也为利用角蛋白酶改善药物在角蛋白中的通透性，提高皮肤外用药物的疗效，特别是在银屑病、角化过度性皮肤病和甲病中的治疗应用研究打下了基础。 方法：实验内容共分3部分，实验方法简述如下： 1．纯化人角蛋白诱导皮肤真菌表达角蛋白酶的实验研究我们采用纯化人角蛋白为底物诱导3种常见皮肤癣菌(须癣毛癣菌、红色毛癣菌和犬小孢子菌)产生角蛋白酶，用紫外分光光度 第四军医大学博士学位论文法比较了3种真菌角蛋白酶的活性、最适PH值和最适温度;并用紫外分光光度法检测了以纯化人角蛋白为底物和以毛发为底物诱导须癣毛癣菌产生角蛋白酶的比活性。 2.须癣毛癣菌角蛋白酶(介Ich叩h少to刀加即tag厂印加teskerat inase，Tri一M一K)的克隆、表达及纯化 用含纯化人角蛋白的诱导发酵培养基培养须癣毛癣菌，以不含人角蛋白的发酵培养基为对照，分离真菌，提取总mRNA，反转录为cDNA，用特异性引物进行PCR扩增。用BamHI、EeoRI双酶切PCR产物及pGEX一4Tn质粒，回收后，用T;DNA连接酶将酶切目的片断连接到pGEX一4T一1载体中，构建GST融合表达载体pGEx一4T一1/T ri一M一K，酶切鉴定并进行基因测序。制备JM109感受态细菌，并将PGEX一4T一1/Tri一M一K转化JMIOg感受态细菌中，挑取阳性克隆，酶切鉴定后，IPTG诱导GST融合Tri一M一K蛋白表达，用GST纯化柱纯化Tri一M一K蛋白，SDS一PAGE凝胶电泳后，经TransillulninatorM一26凝胶成像分析系统扫描定量。 3.纯化Tri一M一K的生物学作用研究 用紫外分光光度法检测了纯化的基因工程须癣毛癣菌角蛋白酶消化人角蛋白的活性、最适pH值和最适温度;SDS一PAGE凝胶电泳观察了纯化的基因工程须癣毛癣菌角蛋白酶对人角蛋白和兔角蛋白的消化作用，Gel一Protein凝胶成像分析系统扫描计算角蛋白酶消化率;用紫外分光光度法检测了须癣毛癣菌角蛋白酶消化人毛发的活性、扫描电子显微镜观察毛发的表面形态变化;原代培养角质形成细胞(keratinocyte，KC)和黑素细胞(melanoeyte，MC)，倒置显微镜观察须癣毛癣菌角蛋白酶作用后角质形成细胞和黑素细胞的形态变化，扫描电子显微镜和透射观察电子显微镜观察须癣毛癣菌角蛋白酶作用后角质形成细胞的形态学变化;用须癣毛癣菌角蛋白酶作用于脂溢性角化病的组织切片，光学显微镜观察组织切片中角质物质的消化情况。 第四军医大学博士学位论文 结果:实验结果按3部分分别叙述如下: 1.纯化人角蛋白诱导皮肤真菌表达角蛋白酶的实验研究 在37℃，pH7 .0，孵育lh的反应条件下，须癣毛癣菌角蛋白酶的比活性为IO20U/mg，红色毛癣菌角蛋白酶的比活性为87OU/mg，犬小抱子菌角蛋白酶的比活性为75OU/mg;须癣毛癣菌角蛋白酶的最适pH值为7.5，红色毛癣菌和犬小抱子菌角蛋白酶的最适pH值测定均为8.0;须癣毛癣菌、红色毛癣菌和犬小抱子菌角蛋白酶的最适温度分别为40℃、45℃和50℃;纯化人角蛋白为底物诱导须癣毛癣菌产生角蛋白酶的比活性高于毛发为底物诱导的须癣毛癣菌角蛋白酶的比活性。 2.Tri一M一K的克隆、表达及纯化 琼脂糖电泳结果发现经角蛋白诱导的须癣毛癣菌能扩增出大小在162bp的条带，而未经角蛋白诱导的须癣毛癣菌则未扩增出目的条带。重组质粒pGEX一4T一1/Tri一M一K用BamHI和EeoRI双酶切，结果显示:Tri一M一K基因已正确插入载体中的相应酶切位点。目的片断测序结果与已知序列一致。诱导表达后SDS--PAGE结果显示:与空载体转化的细菌诱导后蛋白表达比较，含GST/Tri一M一K融合蛋白的细菌克隆诱导后在33kd处有明显的新生蛋白条带。经TransilluminatorM一26凝胶成像分析系统扫描定量，Tri一M一K融合蛋白的表达量约为197林g/m1。阳性细菌克隆诱导表达，细菌裂解后沉淀和上清SDS一PAGE结果显示:在33kd处均有明显的蛋白条带。GST纯化柱纯化的洗脱液SDS一PAGE结果显示33kd的蛋白条带。凝胶经Trans 1 1 luminatorM一26凝胶成像分析系统扫描定量，纯化的Tri一M一K融合蛋白浓度约为98林g/ml。 3.纯化Tri一M一K的生物学作用研究， 在37℃，pH7 .0，孵育lhr的反应条件下，纯化的基因工程须癣毛癣菌角蛋白酶的消化?